慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾RPMI-8226細(xì)胞MIC-1表達(dá)抑制破骨細(xì)胞成熟的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景]
　　多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種惡性漿細(xì)胞增生性腫瘤,占血液系統(tǒng)腫瘤的13％,目前仍是一種無(wú)法治愈的疾病。MM的主要臨床表現(xiàn)為骨痛和溶骨性損害,即骨髓瘤骨病(MBD)。而MBD的效應(yīng)細(xì)胞為破骨細(xì)胞(OC)。OC為一類(lèi)具有骨吸收能力的多核巨細(xì)胞,來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞系,定位于骨髓中。在MM,骨髓微環(huán)境因骨髓瘤細(xì)胞浸潤(rùn)骨髓而發(fā)生改變,OC前體細(xì)胞接受到不正常的信號(hào)刺激而過(guò)度分化成熟,從而造成骨質(zhì)破壞。巨噬細(xì)胞抑制因子1(MIC

2、-1)是人轉(zhuǎn)化因子β超家族成員,生物學(xué)功能復(fù)雜多樣,在MM患者骨髓液中可檢測(cè)到異常高表達(dá),可能是OC新的促進(jìn)因子,參與MBD的發(fā)病過(guò)程。
　　[目的]
　　探討靶向抑制RPMI-8226細(xì)胞MIC-1表達(dá)對(duì)與其共培養(yǎng)的OC分化成熟的影響。
　　[方法]
　　1.通過(guò)密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC),將其放入Transwell小室中的下室,在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和細(xì)胞核因子-кB受體

3、活化因子配體(RANKL)體系下與上室的RPMI-8226細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),并設(shè)立PBMNC單獨(dú)培養(yǎng)為對(duì)照組。用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)牙本質(zhì)片的骨吸收陷窩情況及分析陷窩面積,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD51/CD61表達(dá)情況分析比較兩組OC成熟情況。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各細(xì)胞株中MIC-1表達(dá)情況。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)體外擴(kuò)增MIC-1cDNA片段后與酶切、純化后的表達(dá)載體

4、GV115連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒EGFP-MIC-1-FLAG并進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定,最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中,利用熒光顯微鏡和Westernblot進(jìn)行表達(dá)鑒定。
　　3.設(shè)計(jì)并合成五條MIC-1siRNA靶點(diǎn)序列,并分別連入酶切好的RNAi慢病毒載體GV143。將各連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,并進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。然后分別與表達(dá)載體EGFP-MIC-1-FLAG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,采用Westernblot方法篩

5、選最佳靶點(diǎn)。將含有最佳干擾靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體及包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒,組成三質(zhì)粒包裝系統(tǒng),共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)48h后,收集并濃縮慢病毒液,測(cè)定慢病毒滴度。將不同復(fù)感染指數(shù)(MOI=0,5,10)慢病毒液感染RPMI-8226細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒敲減效率。
　　4.密度梯度法分離人PBMNC并將其放入Transwell小室中的下室,將第三部分中慢病毒感染后的RPMI-8226細(xì)胞放入上室進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。用TRAP染色,甲

6、苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)牙本質(zhì)片的骨吸收陷窩情況及分析陷窩面積,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD51/CD61表達(dá)情況分析OC分化成熟情況。
　　[結(jié)果]
　　1.在與RPMI-8226細(xì)胞共培養(yǎng)后,與對(duì)照組比較,可見(jiàn)較多多核巨細(xì)胞,TRAP染色見(jiàn)胞漿內(nèi)有較多紫紅色顆粒,見(jiàn)3個(gè)至數(shù)十個(gè)不等的淡藍(lán)色胞核,核仁明顯,牙本質(zhì)片甲苯胺藍(lán)染色后可見(jiàn)明顯增多藍(lán)色骨吸收陷窩,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD51/CD61表達(dá)量達(dá)53.88%,較對(duì)照組增多,兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、差異(p<0.05)。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RPMI-8226細(xì)胞高表達(dá)MIC-1。應(yīng)用RT-PCR在體外擴(kuò)增出MIC-1全長(zhǎng),片段大小為946bp,與預(yù)期相符。同時(shí)測(cè)序亦證實(shí),MIC-1基因已被成功插入真核表達(dá)載體。將已測(cè)序成功的含MIC-1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯熒光。Westernblot結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞可檢測(cè)到大小約63kDa的EGFP-MIC-1-FLAG融

8、合蛋白表達(dá),說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,目的基因可在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。
　　3.構(gòu)建及合成五條MIC-1siRNA靶點(diǎn)序列,與已酶切成功的慢病毒載體連接,PCR鑒定和測(cè)序證實(shí)均連接成功。將前部分已構(gòu)建成功的融合基因表達(dá)載體及各重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,WesternBlot結(jié)果顯示MIC-1基因被特異性抑制,且在過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒干擾質(zhì)粒比例為4:1及2:1時(shí),MIC-1-RNAi(shRNA1)靶點(diǎn)對(duì)目的基因的抑制效果最好。成功包裝和濃

9、縮了慢病毒顆粒,經(jīng)熒光法測(cè)定病毒滴度為1×109TU/ml。將收獲的慢病毒轉(zhuǎn)染RPMI-8226細(xì)胞后,CCK-8法檢測(cè)慢病毒感染對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光,感染效率可達(dá)80%以上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示RPMI-8226細(xì)胞MIC-1mRNA表達(dá)明顯下降,驗(yàn)證敲減效率達(dá)75%以上。
　　4.PBMNC與慢病毒感染RPMI-8226細(xì)胞共培養(yǎng)后,與空病毒組相比較,慢病毒感染組多核巨細(xì)胞

10、TRAP染色陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)減少,TRAP活性顯著降低,牙本質(zhì)片骨吸收陷窩明顯減少,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD51/CD61表達(dá)量降低,兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.RPMI-8226細(xì)胞與PBMNC共培養(yǎng)后可促進(jìn)其向OC分化成熟。說(shuō)明此種共培養(yǎng)體系建立成功,此方法可在體外模擬骨髓瘤微環(huán)境,對(duì)體外研究MM中OC分化成熟機(jī)制及調(diào)節(jié)因素提供了簡(jiǎn)潔有效的方法。
　　2.成功構(gòu)建MIC-1融合基因表達(dá)