慢病毒介導(dǎo)靶向沉默Gankyrin基因表達(dá)治療肝細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocullularcarcinoma,HCC)作為人類(lèi)最常見(jiàn)、惡性程度最高的惡性腫瘤之一，有著較高的發(fā)病率和死亡率。我國(guó)是世界上肝癌發(fā)病集中的國(guó)家之一，全球每年新發(fā)生的肝癌患者中有45％在我國(guó)大陸地區(qū)，嚴(yán)重地威脅著人民的身體健康。手術(shù)切除和肝臟移植是目前治療肝癌較為有效的方法，但由于肝癌具有惡性程度高、發(fā)展迅速、容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，肝癌患者中僅有一部分人適合外科手術(shù)治療。絕大部分肝癌患者只能依賴(lài)于放療、化療及其

2、它的一些姑息療法。發(fā)展新的肝癌治療手段和治療途徑已成為廣大醫(yī)務(wù)工作者迫切需要研究和解決的問(wèn)題。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.制備兔抗Gankyrin多克隆抗體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Gankyrin蛋白表達(dá)的定性、定量檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)工具。 2.構(gòu)建并制備攜帶靶向沉默Gankyrin基因shRNA的慢病毒載體，為后續(xù)驗(yàn)證采用該表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行肝癌基因治療有效性的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)提供基本的實(shí)驗(yàn)工具。 3.探討慢病毒介導(dǎo)靶向沉默Gankyr

3、in基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為該系統(tǒng)最終應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.兔抗Gankyrin多克隆抗體的制備、純化及鑒定 1.1采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建pET30a(+)-Gankyrin表達(dá)載體質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定； 1.2通過(guò)IPTG誘導(dǎo)Gankyrin蛋白原核表達(dá)獲得His6-Gankyrin融合蛋白； 1.3以純化的His6-Gankyrin融合蛋

4、白作為抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)制備兔抗Gankyrin多克隆抗體，并進(jìn)行抗體特異性和反應(yīng)性檢測(cè)。 2.靶向沉默Gankyrin基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建和制備 2.1根據(jù)Gankyrin基因(NM002814)CDS區(qū)編碼序列設(shè)計(jì)、選擇三段19nt的寡核苷酸序列作為靶向Gankyrin基因的shRNA片段序列，并以此合成三對(duì)長(zhǎng)引物單鏈DNA片段，經(jīng)退火、雙酶切后與同樣雙酶切的質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6連接、轉(zhuǎn)化，獲得三

5、個(gè)質(zhì)粒； 2.2將獲得的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，以RT-PCR和Westernblot方法篩選對(duì)Gankyrin基因表達(dá)沉默作用最為明顯的質(zhì)粒；再以該質(zhì)粒為基礎(chǔ)通過(guò)基因克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶有靶向沉默Gankyrin基因shRNA片段的慢病毒包裝質(zhì)粒plenti6/V5-shRNA(Gankyrin)-EGFP； 2.3采用Invitrogen公司的四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，制備Lenti-shRNA(Gankyri

6、n)-EGFP慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，并進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量檢測(cè)。 3.重組慢病毒介導(dǎo)靶向沉默Gankyrin基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響 3.1采用構(gòu)建的Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)感染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，分別檢測(cè)該載體系統(tǒng)在體外對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率、GankyrinmRNA和蛋白表達(dá)的影響； 3.2建立肝癌細(xì)胞SMMC-7721移植瘤模型，成瘤后使用Lenti

7、-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行瘤體注射，觀察其對(duì)荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、移植瘤GankyrinmRNA的影響，以及移植瘤形態(tài)學(xué)的改變。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.兔抗Gankyrin多克隆抗體的制備、純化及鑒定 1.1酶切鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的pET30a(+)-Gankyrin表達(dá)載體質(zhì)粒正確，轉(zhuǎn)化入宿主大腸桿菌后通過(guò)IPTG可誘導(dǎo)Gankyrin蛋白； 1.2ELISA和WesternBl

8、ot檢測(cè)結(jié)果顯示，以純化的His6-Gankyrin融合蛋白作為抗原制備的兔抗Gankyrin多克隆抗體有較好的反應(yīng)性和特異性，可以滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。 2.靶向沉默Gankyrin基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建和制備 2.1鑒定結(jié)果顯示3個(gè)攜帶靶向沉默Gankyrin基因shRNA片段的質(zhì)粒構(gòu)建正確，均攜帶有啟動(dòng)EGFP轉(zhuǎn)錄的CMV啟動(dòng)子和啟動(dòng)shRNA序列轉(zhuǎn)錄的U6啟動(dòng)子。RT-PCR和Westernblot方法篩選

9、結(jié)果顯示其中的pDC316-EGFP-U6-shRNA(Cankyrin)1質(zhì)粒剔降SMMC-7721細(xì)胞Gankyrin表達(dá)效果最好。以該質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒包裝質(zhì)粒pLenti6/V5-shRNA(Gankyrin)-EGFP經(jīng)鑒定顯示質(zhì)粒構(gòu)建準(zhǔn)確。 2.2通過(guò)四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染策略制備的高滴度慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP，經(jīng)PCR鑒定和EGFP的活性觀察等檢測(cè)方法，確認(rèn)該慢病毒構(gòu)建正確

10、、滴度高、感染活性高。 3.重組慢病毒介導(dǎo)靶向沉默Gankyrin基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響 3.1MTT法檢測(cè)體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果顯示空白對(duì)照組與慢病毒對(duì)照組細(xì)胞之間相比，細(xì)胞生長(zhǎng)率差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)； 3.2流式細(xì)胞儀對(duì)體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)結(jié)果顯示，Lemi-shRNA(Gankyrin)-EGFP感染細(xì)胞48h后，肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡率明顯

11、高于空白對(duì)照組、慢病毒對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.3Lemi-shRNA(Gankyrin)-EGFP載體表達(dá)系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞GankyrinmRNA水平和Gankyrin蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、慢病毒對(duì)照組之間GankyrinmRNA和Gankyrin蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 3.4全部裸鼠接種肝癌細(xì)胞系SMMC-7721單細(xì)胞懸液后，均存活

12、并有皮下移植瘤形成。 3.5荷瘤裸鼠使用Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行瘤體內(nèi)注射，3w后處死，結(jié)果顯示Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒表達(dá)載體瘤體內(nèi)注射可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)，其移植瘤體積和重量均明顯低于對(duì)照組移植瘤的體積和重量，差異有顯著性意義(P<0.05)。 3.6荷瘤裸鼠移植瘤GankyrinmRNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，Lenti-shRNA(Gan

13、kyrin)-EGFP瘤體內(nèi)注射3w后檢測(cè)裸鼠移植瘤組織GankyrinmRNA水平低于對(duì)照組，差異有顯著性意義(P<0.05)，Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP慢病毒載體系統(tǒng)可顯著抑制肝細(xì)胞癌組織中Gankyrin表達(dá)。 3.7荷瘤裸鼠移植瘤HE及免疫組化染色結(jié)果顯示，Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP瘤體內(nèi)注射裸鼠移植瘤可抑制肝細(xì)胞癌組織中Gankyrin蛋白表達(dá)。 結(jié)論：

14、 1.本課題成功構(gòu)建了pET30a(+)-Gankyrin原核表達(dá)載體，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后通過(guò)IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)的方法獲得了His6-tagged-Gankydn融合重組蛋白。 2.以純化的His6-tagged-Gankyrin融合蛋白為抗原制備的兔抗Gankyrin抗血清，經(jīng)Westernblot檢測(cè)表明其對(duì)His6-tagged-Gankyrin融合重組蛋白和SMMC-7721肝癌細(xì)胞中的Gankyrin蛋白具有較

15、好的反應(yīng)性和特異性。該抗血清可作為免疫反應(yīng)中的抗體用于檢測(cè)Gankyrin蛋白的表達(dá)。 3.利用成功構(gòu)建的慢病毒穿梭質(zhì)粒載體plemi6/V5-shRNA(Gankyrin)-EGFP，通過(guò)四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的策略制備了靶向沉默Gankyrin基因表達(dá)的高滴度重組慢病毒載體Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP，經(jīng)PCR鑒定和EGFP的活性觀察等檢測(cè)方法，確認(rèn)該慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建正確、滴度高、感染活性高，為下一步開(kāi)展靶向

16、Gankyfin基因的肝癌基因治療臨床前研究提供了必須的實(shí)驗(yàn)工具。 4.慢病毒載體系統(tǒng)對(duì)于肝癌細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率，是以肝細(xì)胞為靶細(xì)胞的合適的基因轉(zhuǎn)移載體。利用慢病毒載體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的治療技術(shù)可成為進(jìn)行肝癌基因治療的有效手段。 5.本課題中構(gòu)建的靶向沉默Gankyrin基因慢病毒載體通過(guò)RNAi在體外可有效抑制肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖，剔降肝癌SMMC-772l細(xì)胞系GankyrinmRNA和Gankyri

17、n蛋白的表達(dá)。 6.體內(nèi)注射靶向沉默Gankyrin基因慢病毒載體Lenti-shRNA(Gankyrin)-EGFP可顯著抑制裸鼠肝癌SMMC-7721細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度和移植瘤組織GankyrinmRNA及蛋白表達(dá)水平，該表達(dá)系統(tǒng)可能是肝癌治療的一種有效工具。 本課題的創(chuàng)新性在于： 1.從基因治療的角度探討了慢病毒介導(dǎo)靶向沉默Gankyrin基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞癌的影響及治療意義，為以Gankyrin基