慢病毒介導(dǎo)的ICAM-1基因沉默治療大鼠腎移植模型急性排斥反應(yīng)的實驗研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：大鼠同種異體腎移植模型的建立 目的：建立一種穩(wěn)定、可靠、實用的大鼠同種異體腎移植急性排斥反應(yīng)模型。 方法：1．采用移植腎置于左側(cè)，供腎原位低溫灌洗；移植腎帶主動脈瓣與受體腹主動脈端—側(cè)吻合；供體左腎靜脈連其上方下腔靜脈斷端與受體下腔靜脈端—側(cè)吻合；供體輸尿管帶膀胱瓣與受體膀胱吻合。2．技術(shù)熟練后，行Wistar→SD大鼠腎移植，隨機(jī)分為2組（每組12只）：A組（排斥組），不作任何治療

2、；B組（CsA治療組），術(shù)后使用CsA10d。兩組均行病理檢查和觀察生存期。 結(jié)果：1．經(jīng)過3個月的練習(xí)，建立了比較穩(wěn)定的大鼠同種異體腎移植模型。手術(shù)成功率可達(dá)到90%。2．A組平均存活7．33d；B組平均存活21．2d。術(shù)后7天病理檢查示A組出現(xiàn)明顯的急性排斥反應(yīng)。 結(jié)論：此模型較容易掌握，除常規(guī)顯微外科器械外不需要特殊的器械或設(shè)備。 第二部分：攜帶大鼠ICAM—1基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建、體外鑒定與初步

3、體內(nèi)實驗 目的：1．構(gòu)建攜帶大鼠ICAM—1 RNA干擾的重組慢病毒。2．篩選出基因抑制效率最高的重組慢病毒。3．研究慢病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染主要臟器的有效性。 方法：1．根據(jù)基因序列，設(shè)計并合成針對4個靶點的寡核苷酸，制備雙鏈DNA oligo； HpaⅠ和XhoⅠ酶切pGCL—GFP載體以使其線性化，將其與雙鏈DNA oligo在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選獲得陽性克

4、隆并進(jìn)行基因測序。2．將重組載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293 T細(xì)胞，獲得的病毒顆粒經(jīng)濃縮后測定滴度。3．通過重組慢病毒體外轉(zhuǎn)染NRK細(xì)胞，以RT—PCR和Western Blot法篩選出基因抑制效率最高的重組慢病毒，并將其再次擴(kuò)增、濃縮后測定滴度。4．SD大鼠靜脈注射不同濃度重組慢病毒，分別于96小時、25天后檢測報告基因表達(dá)情況。 結(jié)果：1．經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化后獲得陽性克隆：基因測序結(jié)果完全正確。2．獲得的針對4個靶點

5、的重組慢病毒，經(jīng)RT—PCR和Western Blot法證實，3#病毒在MOI=50時，基因抑制率即達(dá)到88．4%。3．大鼠體內(nèi)實驗表明，20×108 TU重組慢病毒可有效轉(zhuǎn)染各主要臟器，轉(zhuǎn)染25d后大鼠腎組織仍在不斷表達(dá)報告基因。 結(jié)論：1．成功構(gòu)建了含有GFP報告基因的大鼠ICAM—1 RNA干擾慢病毒載體。2．體外實驗證實了該慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)NRK細(xì)胞，并能有效阻斷目的基因的表達(dá)。3．體內(nèi)實驗初步確定了該慢病毒載體的有

6、效性。 第三部分：慢病毒介導(dǎo)的ICAM—1基因沉默治療大鼠腎移植模型急性排斥反應(yīng) 目的：1．研究攜帶大鼠ICAM—1 RNA干擾的重組慢病毒抑制移植腎ICAM—1基因表達(dá)的作用。2．探討慢病毒介導(dǎo)的ICAM—1基因沉默防治大鼠腎移植模型急性排斥反應(yīng)的作用效果和機(jī)理。3．初步探討慢病毒載體結(jié)合RNA干擾應(yīng)用于同種異體移植排斥的效果和前景。 方法：1．供體為Wistar大鼠、受體為SD大鼠腎移植，隨機(jī)分為4組（每組1

7、2只）：a組（同系對照組）；b組（排斥組），不作任何治療：c組（空白對照病毒組）：供體術(shù)前96小時尾靜脈輸注空白對照病毒20×108 TU：d組（治療組）：供體術(shù)前96小時尾靜脈輸注rICAM重組慢病毒20×108 TU。2．腎移植術(shù)后觀察生存期，并抽取外周血，檢測腎功能，ELISA法檢測血清IL—2、ICAM—1的濃度。3．腎移植術(shù)后7天取移植腎，RT—PCR和Western Blot法檢測移植腎ICAM—1的表達(dá)：HE染色觀察病理變

8、化。 結(jié)果：1．腎移植術(shù)后治療組生存期達(dá)23．8天，與b、c兩組（僅為7．3、7．0天）相比有統(tǒng)計學(xué)差異。2．腎移植術(shù)后治療組血清Cr、IL—2、ICAM—1的濃度與同系對照組相比無顯著差別，而與b、c兩組差別巨大。3．腎移植術(shù)后7天，治療組移植腎ICAM—1表達(dá)明顯被抑制。HE染色提示移植腎Banff0～ⅠA級，而b、c組移植腎BanffⅡB—ⅢA級。 結(jié)論：1．?dāng)y帶ICAM—1 RNA干擾的重組慢病毒可以有效地、特異