MiRNAs在大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中的早期診斷作用.pdf

1、研究背景:自二十世紀(jì)初期，就有學(xué)者開(kāi)始嘗試動(dòng)物腎移植，Ullmann和Decastello在1902年成功地完成了同種動(dòng)物腎移植。1954年，世界第1例同卵雙生兄弟間的腎移植手術(shù)，獲得成功，開(kāi)啟了腎移植的新紀(jì)元，在二十一世紀(jì)最初十年，就有從5萬(wàn)人左右上升到近10萬(wàn)人在美國(guó)器官分享聯(lián)合網(wǎng)(UNOS)上注冊(cè)等待接受腎移植，且逐年攀升。我國(guó)吳階平院士，在1960年最先進(jìn)行了首例人體腎移植。到1970年末，腎移植作為治療尿毒癥的一種有效手段在大

2、城市逐漸推廣。歷經(jīng)一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，腎移植作為治療終末期腎臟疾病方法，已是首選。正是由于新型免疫抑制劑的大力研發(fā)，加之組織配型技術(shù)的成熟，才使得腎移植獲得了舉世矚目的成就。但急性排斥反應(yīng)(AR)仍是腎移植患者術(shù)后經(jīng)常面臨的最常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)之一。AR的發(fā)生相當(dāng)程度上影響了人腎的長(zhǎng)期存活率及生活質(zhì)量，所以， AR的早期診斷和治療就顯得刻不容緩。
　　 臨床上目前診斷AR，主要從臨床特征、血生化指標(biāo)變化如血肌酐值升高、尿量減少、體重增加、發(fā)

3、熱，伴或不伴蛋白尿、血尿等現(xiàn)象，但往往是出現(xiàn)在移植腎已有病理改變之后，傳統(tǒng)方法尚不能預(yù)警診斷AR。在歐美，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)AR得益于臨床上程序性活檢開(kāi)展良好，但因其不屬于無(wú)創(chuàng)性檢查，且可能出現(xiàn)并發(fā)癥，我國(guó)患者普遍不能接受。國(guó)內(nèi)外有研究者利用的血、尿標(biāo)記物如Perforifractalkine、GB、IP21、FOXP3、PI等診斷AR，但其敏感性、特異性不高。彩色多普勒通過(guò)評(píng)價(jià)移植腎血流灌注來(lái)判斷急性排斥反應(yīng)，但是，慢性排斥反應(yīng)、免疫抑制劑中

4、毒、移植腎動(dòng)脈狹窄等術(shù)后并發(fā)癥同樣會(huì)出現(xiàn)阻力指數(shù)(RI)等血流參數(shù)的變化。MR擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI)檢查由于其可以評(píng)價(jià)早期移植腎血流灌注，或許能作為監(jiān)測(cè)移植腎急性排斥反應(yīng)的一種無(wú)創(chuàng)性檢查，但是腎臟表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADC) ADC值波動(dòng)較大.因此還需深入研究。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，是調(diào)控

5、基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，廣泛參與了機(jī)體的各種的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，miRNAs效應(yīng)分子參與了免疫反應(yīng)的各個(gè)階段，與T、B細(xì)胞的分化發(fā)育及B細(xì)胞抗體的類別轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，具有免疫調(diào)控的作用。miRNAs與AR的發(fā)生有著緊密聯(lián)系[3-6]。南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院器官移植科2009級(jí)碩士研究生課題中提出在小鼠皮膚移植急性排斥反應(yīng)中miR-142-5p、miR-155存在著過(guò)高的表達(dá)。Angli

6、cheau et al.[4]研究發(fā)現(xiàn)在腎移植急性排斥反應(yīng)患者的腎穿組織與正常移植腎比較，miRNA-let-7c,miRNA-10a, miRNA-10b,miRNA-125a, miRNA-200a,miRNA-30a-3p,miRNA-30b,miRNA-30c,miRNA-30e-3p and miRNA-32表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)表達(dá)的有miRNA-142-5p，miRNA-142-3p，miRNA-155，miRNA-223，mi

7、RNA-146b，miRNA-146a，and miRNa-342。Sui W et al[6]等研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者， miRNA-324-23p， miRNA-611，miRNA-330,miRNA-524, miRNA-17-3p, miRNA-483, miRNA-663,miRNA-516-5p，miRNA-326，miRNA-197 and miRNA-346表達(dá)下調(diào)，miRNA-658，miRNA-1

8、25a,miRNA-320,miRNA-381,miRNA-628,miRNA-602,miRNA-629andmiRNA-125a表達(dá)上調(diào)。Putta et al等在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miRNA-192通過(guò)降低膠原蛋白、TGF-β和纖維連接蛋白的表達(dá)進(jìn)而減慢腎纖維化的進(jìn)程。Zhou等發(fā)現(xiàn)狼瘡病人合并腎損害尿中miR-27b、miR-192高表達(dá)。由此可見(jiàn)，MiRNAs參與了腎移植術(shù)后患者排斥反應(yīng)及移植腎纖維化的疾病演變過(guò)程中，所以，通過(guò)構(gòu)

9、建不同大鼠腎移植模型，并檢測(cè)血液中miR-192、miR-320和miR-223的變化，來(lái)探討其是否對(duì)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生起到預(yù)警診斷的作用。
　　 根據(jù)國(guó)內(nèi)外大鼠腎移植模型文獻(xiàn)報(bào)道，選擇Wistar-SD作為供受體研究所需的大鼠腎移植模型，并通過(guò)檢測(cè)不同大鼠移植模型中miRNAs的變化，來(lái)探索尋找無(wú)創(chuàng)檢測(cè)AR的特異性生物學(xué)標(biāo)記物。
　　 目的:
　　 1.建立大鼠腎移植模型。
　　 2.探討血液中miRN

10、As在大鼠腎移植模型的表達(dá)水平變化。
　　 方法: 建立大鼠腎移植模型
　　 1)動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)分兩組;Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者建立同種異體基因移植組(急性排斥反應(yīng)組)。Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者術(shù)后給予環(huán)孢素A(CsA)免疫抑制(術(shù)后第1天起，CsA按2 mg/kg腹腔注射、1次/天)建立同種異體基因移植免疫抑制組(正常腎移植組)，每組10對(duì)。
　　 2)腎移植:1％戊巴比妥鈉注射麻醉后

11、，采用原位低溫肝素鈉灌注切取供體左腎，受體于原位在顯微外科操作下腎動(dòng)脈端端吻合、腎靜脈硬膜外導(dǎo)管支架端端吻合、輸尿管端端吻合大鼠腎移植手術(shù)。
　　 3)術(shù)后觀察: 預(yù)實(shí)驗(yàn)后期，兩組大鼠腎移植術(shù)后第1、3、5、7天，取出移植腎，浸入10％中性福爾馬林，切片并進(jìn)行HE染色進(jìn)行病理檢查。正式實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察攝食、飲水、尿量等一般生存情況及大鼠齒齦、皮毛、活動(dòng)等個(gè)體狀況。尿量＞5mL/d，手術(shù)成功，尿量＜1mL/d，需行活檢明確病因。

12、
　　 探討血液中miRNAs在不同大鼠腎移植模型的表達(dá)水平變化:
　　 1)動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)分兩組;Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者建立同種異體基因移植組(急性排斥反應(yīng)組)。Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者術(shù)后給予環(huán)孢素A(CsA)免疫抑制(術(shù)后第1天起，CsA按2 mg/kg腹腔注射、1次/天)建立同種異體基因移植免疫抑制組(正常腎移植組)，每組10對(duì)。
　　 2)腎移植:1％戊巴比妥鈉注射麻醉后，

13、采用原位低溫肝素鈉灌注切取供體左腎，受體于原位在顯微外科操作下腎動(dòng)脈端端吻合、腎靜脈硬膜外導(dǎo)管支架端端吻合、輸尿管端端吻合大鼠腎移植手術(shù)。
　　 3)血液中miRNAs的檢測(cè):兩組分別于術(shù)前(day0)、術(shù)后第一天(day1)、術(shù)后第三天(day3)、術(shù)后第五天(day5)、第七天(day7)斷尾采血2mL，血液樣本采用EDTA抗凝，-80℃保存。采用miRNA提取試劑盒提取RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后采用熒光定量PCR法檢測(cè)mi

14、r-192、mir-320及mir-223的表達(dá)量。根據(jù)樣本擴(kuò)增曲線圖和融解曲線圖，測(cè)量熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)次數(shù)(Ct值)，所得數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。單因素的組間比較采用單向方差分析，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，析因設(shè)計(jì)資料的組間比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，多重比較時(shí)若滿足方差齊

15、性采用Bonferroni法，若方差不齊采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.兩組大鼠存活狀況及并發(fā)癥預(yù)實(shí)驗(yàn)共用50對(duì)大鼠，其中Wistar、SD大鼠分別為50只，用于練習(xí)制作大鼠腎移植模型，在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，受者都常規(guī)在術(shù)后3天予以結(jié)扎右腎動(dòng)脈造成右腎缺血壞死，觀察14天，記錄大鼠存活狀況以及各種術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況，(見(jiàn)表1)。練習(xí)了顯微技能及模型制作，于3個(gè)月后，開(kāi)始

16、正式實(shí)驗(yàn)，正式實(shí)驗(yàn)大鼠共20對(duì)，其中Wistar、SD大鼠分別為20只(非實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)死亡的大鼠均依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再補(bǔ)充完整)，記錄大鼠存活狀況以及各種術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況，(其中死亡大鼠指非按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃處死的大鼠)(見(jiàn)表1)。在正式實(shí)驗(yàn)階段，供體手術(shù)1～1.5h，受體腎移植血管吻合總時(shí)間(30±3)min，輸尿管吻合時(shí)間(12±2)，手術(shù)時(shí)間1.5～2h。
　　 2.兩組大鼠腎組織病理學(xué)觀察正常腎移植組腎臟外觀和光鏡下組織觀察基本正常，急

17、性排斥組移植腎外觀蒼白腫脹，光鏡下腎間質(zhì)呈彌漫性水腫，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞多灶狀或彌漫性浸潤(rùn)，并侵入腎小管管壁出現(xiàn)腎小管炎，部分腎小球內(nèi)可見(jiàn)單個(gè)核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。急性排斥組大鼠術(shù)后1、3、5、7d組織病理學(xué)診斷均有AR。
　　 兩組大鼠不同時(shí)間血液中三種miRNA的變化不同組間mir-192的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=23.153，P=0.000);不同時(shí)間之間的mir-192的相對(duì)表達(dá)水平亦有顯著性差異(F=24.01

18、9，P=0.000);組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)顯著(F=13.639，P=0.000)。
　　 在術(shù)后第五天(day5)，兩組間mir-192的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=19.490，P=0.002)，急性排斥組較正常腎移植組顯著升高(P=0.002)。
　　 不同組間mir-320的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=16.925，P=0.001);不同時(shí)間之間的mir-320的相對(duì)表達(dá)水平亦有顯著性差異(F=13.33

19、4，P=0.000):組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)不顯著(F=2.978，P=0.128)。
　　 在術(shù)后第五天(day5)，兩組間mir-320的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=10.172，P=0.020)。
　　 不同組間mir-223的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(F=1.279，P=0.360);不同時(shí)間之間的mir-223的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=13.987，P=0.000);組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)不顯著(F

20、=0.479，P=0.870)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Wistar為供者，SD為受者，采用腎動(dòng)脈端端吻合、靜脈硬膜外導(dǎo)管支架吻合、輸尿管端端吻合能建立穩(wěn)定的腎移植急性排斥反應(yīng)模型。
　　 2.大鼠血液中mir-192和mir-320在腎移植急性排斥反應(yīng)早期表達(dá)升高，可以用于大鼠急性排斥反應(yīng)的早期預(yù)測(cè)。
　　 3.大鼠血液中mir-223在腎移植急性排斥反應(yīng)早期未有明顯升高，不能用于大鼠急性排斥反應(yīng)的早