內(nèi)皮微粒在大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)和慢性環(huán)孢素腎病中的意義.pdf

1、目的：研究內(nèi)皮微粒(EMP)在鑒別腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)(AR)和慢性環(huán)孢素腎病(CCN)中的意義，并通過體外研究觀察EMP對單核細胞功能的影響，探索EMP在CCN發(fā)病機制中可能存在的作用。
　　 方法：（第一部分）
　　 1．構(gòu)建大鼠腎移植模型：在參考已有大鼠腎移植模型構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，分別對動、靜脈吻合方式進行適當(dāng)改進，成功構(gòu)建了大鼠原位腎移植模型。
　　 2．實驗動物分組及標(biāo)本采集：(1)同種同基因組移植對

2、照組(Control-7days組，n=9)：供、受體均為SD大鼠。(2)同種異基因移植7天組AR組(AR7days組，n=8)：供體為Wistar、受體為SD大鼠。(3)同種同基因移植術(shù)后環(huán)孢素7天組（CsA-7days，n9）：供、受體均為SD大鼠。(4)同種同基因移植術(shù)后環(huán)孢素28天組（CsA-28days組，即CCN組，n=8）：供、受體均為SD大鼠；實驗大鼠按照時間點分別于造模成功時經(jīng)腹主動脈取抗凝血5ml，高速離心分離得劍含

3、EMP血漿，-80℃保存，同時摘取供腎，10％中性甲醛固定。
　　 3．通過HE染色方法檢測移植腎臟組織病理學(xué)改變，Banff97分級評分標(biāo)準(zhǔn)，確定模型構(gòu)建成功與否。
　　 4．模型動物循環(huán)EMP的表型分析：應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測APC-CD144/PE-CD62E雙陽性EMP和PE-perforin/APC-CD144雙陽性EMP在APC-CD144陽性EMP總數(shù)中的百分比的芹異，結(jié)果分別用CD144+CD62E+EMP％

4、和CD144+perforin+EMP％表示。
　　 方法：（第二部分）
　　 1．免疫組織化學(xué)方法檢測第一部分實驗中CsA-28days組（CCN模型）和對照組（Control-7days）動物模型腎臟組織中ED-1抗原的表達差異。
　　 2．體外EMP的產(chǎn)生與計數(shù)：CsA刺激培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EAhy926產(chǎn)生EMP，用流式細胞術(shù)分析CD144陽性EMP的數(shù)量。
　　 3．CsA刺激產(chǎn)生的EMP

5、對人單核細胞株THP-1細胞的影響：按THP-1細胞與EMP的數(shù)量的比例關(guān)系分組，另設(shè)50μg/mlLPS作為陽性對照組，D-Hanks作為陰性對照組，分組為：①空白對照組（加入等體積的D-Hanks作為Control組）;②低濃度EMP組（1:25EMP組）;③中濃度EMP組(1:50EMP組);④高濃度EMP組（1:100EMP組）;⑤50μg/LLPS陽性對照組。應(yīng)用ELISA方法測定各組THP-1細胞分泌TNF-α的水平，同時應(yīng)

6、用RT-PCR技術(shù)檢測各組THP-1細胞MCP-1mRNA、HLA-DRmRNA、CCR2mRNA表達水平的差異。各種結(jié)果的差異應(yīng)用SPSS18.0軟件統(tǒng)計分析，P值均＜0.05。
　　 結(jié)果:（第一部分）
　　 1．成功構(gòu)建大鼠原位腎移植模型，病理結(jié)構(gòu)顯示所構(gòu)建的AR模型和CCN模型符合文獻診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2．各實驗組血漿CD144+CD62E+EMP％表型差異結(jié)果((-x)±SD)：
　　 (1)C

7、ontrol-7days組(n=9)：(28.11±6.37)％；(2)AR-7days組(n=8)：(60.75±5.90)％:(3)CsA-7days組(n=9)：(33.78±7.82)％;(4)CsA-28days組(n=8)：(75.37±8.00)％；基本趨勢是：(4)＞(2)＞(3)≥(1)。
　　 3．各實驗組血漿CD144+perforin+EMP％表型差異結(jié)果((Norling，Tufro-McReddie

8、et al.1996)(?)±SD):(1)Control-7days組(n=9)：(10.67士2.24)％;(2)AR7days組(n=8):(2().37±2.77)％;(3)CsA-7days組(n=9):(11.44±3.17)％;(4)CsA-28days組(n=8):(15.38±3.02)％?；沮厔菔牵?2)＞(4)≥(3)≥(1)。
　　 結(jié)果:（第二部分）
　　 1．與Control組相比，大鼠環(huán)孢

9、素腎病模型（CCN組）移植腎組織中發(fā)現(xiàn)大量ED-1陽性單核巨噬細胞浸潤。
　　 2．EMP刺激THP-1細胞MCP-1 mRNA、HLADRmRNA、CCR2 mRNA以及TNF-α表達水平的差異：與D-Hanks Control組相比，上述指標(biāo)的量隨著EMP數(shù)量的升高而升高，且1∶100組、1∶50 EMP組與Control差異具有顯著性，P＜0.05，而1∶25EMP組差異不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1．體

10、內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)CD144+ perforin+ EMP和CD144+ CD62E+ EMP在大鼠腎移植術(shù)后引起的急性排斥反應(yīng)模型和慢性環(huán)孢素腎病模型中的表達存在顯著差異，大鼠腎移植術(shù)后AR模型與CCN模型相比，循環(huán)血中總CD144+EMP中CD144+perforin+EMP比率較高，CD144+CD62E+EMP的比率較低。這種表型差異在腎移植術(shù)后引起的急性排斥反應(yīng)和慢性環(huán)孢素腎病的鑒別中具有重要的參考價值。
　　 2．體外研究發(fā)