BTLA和ICOS早期預測腎移植術后急性排斥反應的臨床研究.pdf

1、腎移植是目前終末期腎病患者最理想、最經濟的一種治療方法，以同種異體尸體腎移植為主，移植后易發(fā)生排斥反應。盡管隨著現(xiàn)代強效非特異性免疫抑制劑的發(fā)展和臨床應用，同種異體器官移植取得了長足的進步，急性排斥反應發(fā)生率明顯減少，但急性排斥反應臨床表現(xiàn)也越來越不典型，往往需要移植腎病理學檢查。雖然病理學檢查是臨床診斷的金標準，但此法即昂貴又不方便還易引起腎損傷導致各種并發(fā)癥。因此，尋找經濟方便、無創(chuàng)傷、具有高度敏感性和特異性的檢測指標對預測急性排斥

2、反應的發(fā)生和提高移植腎的存活率十分重要。
　　 器官移植排斥反應主要是激活了受體體內的細胞免疫機制，即受體免疫系統(tǒng)識別異體抗原引起效應T細胞激活和釋放一系列效應分子攻擊和排斥異體移植器官。T細胞在移植排斥反應中起核心作用。T細胞活化、克隆增殖和產生細胞因子需要兩種信號參與：第一信號是由T細胞受體(TCR)與抗原呈遞細胞(APC)表面的MHC抗原復合物相互作用產生；第二信號為共刺激信號，由可溶性共刺激分子或APC表面的分子配體提供

3、。
　　 B、T淋巴細胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白表面分子家族成員，其與細胞毒T淋巴細胞抗原-4(CTIA-4)、程序壞死因子-1(PD-1)構成了一組抑制性受體，主要在T、B淋巴細胞上表達。BTLA與其配體結合后，對活化的T細胞可產生抑制效應，從而防止過強的細胞免疫應答，維持免疫耐受，保護機體免受自身免疫反應的損傷。皰疹病毒進入介質(Herpes Vi

4、rus Entry Mediator，HVEM)是BTLA的特異性配體，二者結合產生協(xié)同抑制信號；而HVEM與腫瘤壞死因子超家族成員LIGHT結合則產生協(xié)同刺激信號?？烧T導共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)是T細胞膜表面的共刺激因子，其配體ICOSL，亦稱為GL-50、B7相關蛋白-1(B7RP-1)或B7同源蛋白(B7h)，參與T細胞效應階段的調節(jié)，對T、B淋巴細胞的增殖與活化、各種細胞因子的產生與分

5、泌起重要作用。ICOS/ICOSL共刺激通路阻斷后伴有多種細胞因子和趨化因子的下調。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在明確腎移植患者以臨床常規(guī)使用的免疫抑制劑三聯(lián)治療措施預防急性排斥反應過程中，BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL在外周血淋巴細胞表達及血清相關細胞因子的變化。評價BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL對腎移植急性排斥反應發(fā)生的早期預測作用，為臨床早期診斷提供新的無創(chuàng)傷、具有高度敏感性和特異性的急性

6、排斥反應預測指標，以便預防和及時治療腎移植急性排斥反應，提高患者移植腎的存活率，改善腎移植患者的生存率和生活質量。
　　 研究方法:
　　 1.標本采集：選取自我院2008年2月至2011年2月終末期腎病患者行腎移植手術281例，尸體供腎，熱缺血時間<8min、冷缺血時間<10小時，腎移植術后應用MMF+CSA+Pred或MMF+FK506+Pred三聯(lián)藥物治療，排除應用賽尼哌、OKT3、ALG等單克隆抗體、多克隆抗體的

7、患者，以排除對監(jiān)測指標的影響；排除發(fā)生術后感染、手術等并發(fā)癥；排除發(fā)生移植腎功能延期恢復者。根據(jù)Banff2005標準診斷急性排斥反應并進行分組，分為移植腎功能穩(wěn)定組和腎移植急性排斥組。入組的急性排斥患者必須滿足發(fā)生AR時間為10±2天，并且應用MP沖擊治療3天(MP500mg/d)效果顯著，排斥得到逆轉這一條件，不符合者剔除。隨機選取20例移植腎功能穩(wěn)定患者、20例發(fā)生急性排斥反應患者。觀察40例病人一般情況，尿量、腎功能、血藥濃度、

8、T細胞亞群等，于手術當日(術前)及術后第3、7、14、28天采集外周血分離淋巴細胞和血清進行實驗。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核同意。
　　 2.RT-PCR、實時熒光定量PCR檢測外周血淋巴細胞中BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL mRNA表達水平。采用TRIZOL法提取RNA，由公司合成PrimerPrimier5設計的引物序列，進行常規(guī)PCR反應。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并讀

9、取、分析像素值。
　　 3.流式細胞術檢測外周血淋巴細胞BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL的表達水平。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的濃度。取腎移植術前及術后3、7、14、28天的外周血，分離血清-80℃保存。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的含量的檢測嚴格按照ELIS

10、A試劑盒說明書進行操作，并用酶標儀在450nm波長測量0.D。值。
　　 5.SPSS12統(tǒng)計軟件、Graphpad Prism5.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，比較術后不同時間、不同組別之間共刺激分子或共抑制分子及細胞因子表達水平差異，并分析與腎移植急性排斥反應發(fā)生的相關性。計量資料采用均數(shù)±標準差(x±S)表示，采用兩個獨立樣本t檢驗比較CR組和正常組的均數(shù)，數(shù)據(jù)間比較應用方差分析，技術資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意

11、義。
　　 結果:
　　 1.兩組病人一般臨床特征，包括性別、年齡、熱缺血時間、冷缺血時間及術后免疫抑制劑方案等方面，兩組間比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 2.外周血淋巴細胞BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL表達水平：RT-PCR、q-PCR和流式細胞術結果一致顯示，移植后第3天各分子相對表達量較移植前明顯升高，第7、14、28天各分子相對表達量逐漸下降。而腎移植術后發(fā)生急性排斥反應的患者BTL

12、A、HVEM、ICOS、ICOSL表達水平與腎功能穩(wěn)定組相比都有顯著升高，以術后第7～14天：BTLA、ICOS升高最為顯著(P<0.01)。
　　 3.外周血淋巴細胞IL-2、IFN-γ、IL.10、IL-4 mRNA表達水平：移植后第3天各分子相對表達量較移植前明顯升高，腎功能穩(wěn)定組用藥后第7、14、28天各分子相對表達量逐漸下降，腎移植術后急性排斥組IL-2、IFN-γ表達水平在第14天出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，與移植

13、排斥反應出現(xiàn)的時間密切相關。
　　 4.血清IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4濃度：移植后第3天各分子血清濃度較移植前明顯升高，腎功能穩(wěn)定組用藥后第7、14、28天各分子血清濃度逐漸下降，腎移植術后急性排斥組IL-2、IFN-℃表達水平在第14天出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，與移植排斥反應出現(xiàn)的時間密切相關。
　　 5.分析BTLA、ICOS表達與急性排斥反應發(fā)生的相關性：BTLA、ICOS及細胞因子IL-2和I

14、FN-γ均較臨床指標(BUN、Cr)能夠提前判斷是否發(fā)生急性排斥反應。外周血淋巴細胞上的BTLA、ICOS與臨床指標比較P<0.01，細胞因子IL-2和IFN-γ與臨床指標比較P<0.05，說明這幾項指標與臨床診斷指標相比具有顯著的統(tǒng)計學差異，可以比臨床現(xiàn)有診斷指標提前預知腎移植患者移植后是否發(fā)生急性排斥反應。
　　 6.將各指標聯(lián)合，觀察聯(lián)合指標與臨床確診的符合情況：判斷各組合指標的靈敏度都比較好，從單個指標來看，IL-2的效

15、果最好，其靈敏度和特異度都比較高，其Youden指數(shù)達到0.8500，尤其是在檢測了IL-2這個指標之后，在任意添加其他一個指標或多個指標，其靈敏度都達到100％。在BTLA、IFN-γ及組合BTLA+IFN-γ、ICOS+IFN-γ這幾個指標的靈敏度都比較高，但是特異度較低，容易造成假陽性結果。BTLA和ICOS作為單個指標，其靈敏度和特異度都比較高，二者聯(lián)合之后的靈敏度和特異度也比較高。
　　 結論:
　　 本研究通

16、過RT-PCR、q-PCR及流式細胞術等方法檢測了腎移植患者術前與術后不同時間段外周血淋巴細胞中BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL的表達水平，以及相關細胞因子在外周血淋巴細胞的基因表達和血清濃度變化。結果顯示，術前BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL均表達不明顯，術后第3天均表達明顯增加，用藥后第7、14、28天表達水平逐漸下降；器官移植急性排斥反應常發(fā)生于術后5天～3月，細胞因子的變化可以作為排斥反應發(fā)生的指標之一。本研究證