腎移植受者術(shù)前MICA抗體陽性對(duì)移植后早期急性排斥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的和意義:
　　 外科技術(shù)的不斷進(jìn)步和新型免疫抑制劑的產(chǎn)生，腎臟移植已經(jīng)成為臨床上治療腎功能衰竭的最有效手段。急性排斥反應(yīng)是腎移植術(shù)后常見的并發(fā)癥，是導(dǎo)致移植物功能喪失和長期存活失敗的重要危險(xiǎn)因素之一。排斥反應(yīng)分為細(xì)胞性排斥反應(yīng)和體液性排斥反應(yīng)，其中細(xì)胞免疫在排斥反應(yīng)過程中起著重要作用，但體液免疫在腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)中也起著非常重要的作用。一般認(rèn)為針對(duì)人類組織相容性抗原(Humanleucocyteantigen，HLA)的抗

2、體為與腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)及移植腎存活率密切相關(guān)的體液性因素，特別是移植前受者體內(nèi)針對(duì)供者的特異性抗體可以導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)發(fā)生。然而，即便是供受者之間HLA基因完全匹配，腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)仍可能發(fā)生。因此，人們認(rèn)識(shí)到一些非HLA抗體也可以介導(dǎo)體液性排斥反應(yīng)。MIC基因位于人體6號(hào)染色體上，是跨越人類組織相容復(fù)合物1(MHC-Ⅰ)類2Mb長度區(qū)域的基因家族，此家族與經(jīng)典的HLA-Ⅰ類基因同源性很高，但分子結(jié)構(gòu)和功能不同，它包括MICA、M

3、ICB、MICC、MICD、MICE、MICF6個(gè)成員，其中只有MICA和MICB編碼、表達(dá)。MIC基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與MHC-Ⅰ類分子結(jié)構(gòu)類似，含383-389個(gè)氨基酸的多肽，包含有3個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域(α1，α2，α3)，α1、α2形成了抗原結(jié)合部位。MIC基因編碼的分子是與NKG2D分子相結(jié)合，不與T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)相結(jié)合，不與β2微球蛋白相連，不與肽段結(jié)合，與抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporterass

4、ociatedwithantigenprocessing，TAP)無關(guān)。MICA基因具有高度多態(tài)性，目前至少發(fā)現(xiàn)61個(gè)等位基因，其多態(tài)性主要體現(xiàn)在外顯子3，4和跨膜區(qū)的微衛(wèi)星序列。經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子廣泛分布于人體有核細(xì)胞，MICA基因主要表達(dá)于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，尤其是腸道上皮細(xì)胞，也表達(dá)在大多數(shù)上皮性腫瘤細(xì)胞（胃癌、肺癌等）中，并主要與活化的巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞上的NKG2D/DAP10受體結(jié)合，激活這些細(xì)胞的細(xì)

5、胞毒作用，誘導(dǎo)合成INF-γ等細(xì)胞因子，破壞移植物功能。MICA基因還存在明顯的種族差異性，白種人群中MICA的多態(tài)性，MICA008基因頻率最高(53％)、MICA002(13％)、MICA009(3％)日本人群中MICA008基因頻率最高(30.8％)、MICA009(16.5％)、MICA007最罕見。主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類相關(guān)鏈A抗原(majorhistocompatibilitycomplexclassⅠ-relatedch

6、ainA，MICA)作為目前非HLA抗原中重要的具有高度多態(tài)性的糖蛋白抗原，是細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的多態(tài)性分子。MICA抗原可能在移植排斥中通過激活抗體介導(dǎo)或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而起作用。Hankey等通過免疫組化的方法檢測(cè)移植腎臟或胰腺組織中MICA基因表達(dá)，在所有出現(xiàn)急性腎小管壞死(ATN)以及急性排斥反應(yīng)的患者組織中都出現(xiàn)MICA基因的表達(dá)，在正常腎臟組織中沒有MICA基因的表達(dá)，提示細(xì)胞表面MICA基因表達(dá)與細(xì)胞損傷之間存在關(guān)聯(lián)。M

7、ICA抗原作為一個(gè)多態(tài)性抗原，能夠誘導(dǎo)移植腎患者產(chǎn)生特異性抗體。有研究證實(shí)許多配型良好的移植患者近期急性排斥反應(yīng)和遠(yuǎn)期慢性移植物血管病發(fā)生率卻高于配型不佳的移植患者，盡管大多數(shù)發(fā)生排斥反應(yīng)的腎移植受體會(huì)產(chǎn)生HLA抗體，但部分不產(chǎn)生HLA抗體卻發(fā)生移植排斥的受者中有1/3以上存在MICA抗體，2005年KazuoMizutani對(duì)腎移植受者發(fā)生排斥反應(yīng)的腎臟透析洗脫液的研究發(fā)現(xiàn)MICA抗體與移植腎功能和存活有關(guān)，也參與了排斥反應(yīng)過程中的變

8、化，提示MICA抗體可能影響移植腎存活率，2007年Arundhati回顧性的研究了185例腎移植術(shù)后患者血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)MICA抗體陽性組患者AR發(fā)生率為33％，MICA抗體陰性組AR發(fā)生率為14％(P=0.03)。以上研究均證明MICA抗體與腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)和移植物丟失具有明顯相關(guān)性。所以MICA抗體與腎移植的關(guān)系更值得關(guān)注。本課題就MICA抗體在等候腎臟移植的人群中的抗體特異性分析及術(shù)前MICA抗體對(duì)腎移植術(shù)后早期急性排斥反應(yīng)發(fā)生

9、、移植腎功能的影響等方面展開一些探討和研究。
　　 第一部分MICA抗體在等候腎臟移植受者中的抗體特異性分析
　　 方法:
　　 選取2009年12月-2010年10月行MICA抗體檢測(cè)及MICA抗體特異性分析的197例腎移植受者。MICA熒光微球由鄒義洲教授惠贈(zèng)，包被10種MICA抗原，即MICA001,MICA002,MICA004,MICA007,MICA009,MICA012,MICA0015、MICA0

10、17，MICA018，MICA019，MICA027。采用液相芯片分析技術(shù)，在包被已知MICA抗原的熒光微球中加入患者血清，再加入R-藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的羊抗人IgG，重懸熒光微球，Luminex機(jī)上閱讀。使用DataCollectorVersion1.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以雙色激光分別讀取每個(gè)MICA抗原＞100個(gè)微球，經(jīng)分子PE熒光強(qiáng)度獲得cut-off分值，判讀出0、2、4、8，將OD值≥4定為抗MICA抗體陽性，并獲得抗MIC

11、A抗體特異性。根據(jù)抗MICA抗體是否陽性分為抗MICA抗體(+)組和抗MICA抗體(-)組，在MICA抗體(+)組中計(jì)算各特異性MICA抗體的頻率（某特異性抗體出現(xiàn)頻率=該特異性抗體出現(xiàn)次數(shù)/所有特異性抗體出現(xiàn)的總次數(shù)）及表達(dá)單特性抗體、多特異性抗體的受者占所有MICA抗體陽性者的百分比。
　　 結(jié)果:
　　 197例術(shù)前的腎移植受者中，45例檢測(cè)到MICA抗體，陽性率為22.84％。檢測(cè)的MICA抗體分別為:1例為MI

12、CA007、027;1例為MICA001、002、007、012、017、018、019;1例為MICA001;2例為WeakMICA001;4例為WeakMICA019;1例為MICA007、weak027;9例為MICA019;1例為MICA019、027、weak004、009;1例為MICA001、weak019;1例為MICA002、019;2例為MICA002、018、007、019、001、012、017、015、027、

13、004、009;1例為MICA019、027、004、009、002、007、018;1例為MICA001、018、004、009、027;1例為MICA001、018、012;1例為MICA027、009、004、019;2例為MICA027、009、004;1例為001、002、018、027;1例為004、009、027、019、007、018;1例為MICA007;1例為MICA015;1例為MICA002、018、019。其中

14、單特異性MICA抗體有18例，多特異性MICA抗體（特異性抗體≥2個(gè)）有17例。MICA019抗體頻率為65.7％(23/35)、MICA027抗體頻率為34.3％、MICA001抗體頻率為28.6％，MICA004、009、018抗體頻率為25.7％，MICA007抗體頻率為22.9％，MICA002抗體頻率為20％，MICA012抗體頻率為11.4％，MICA015、017抗體頻率均為8.6％。常見為MICA019、027、001、

15、004、009、018等抗體。45例陽性受者中單特異性抗體18例(51.4％)，多特異性抗體17例(48.6％)。
　　 第二部分MICA抗體對(duì)腎移植術(shù)后影響的相關(guān)性研究
　　 方法:
　　 檢測(cè)2009-2010年本院197例未使用免疫抑制劑的腎移植受者術(shù)前MICA抗體及其特異性，隨訪其中139例接受腎移植手術(shù)的受者術(shù)后早期急性排斥反應(yīng)(AR)和移植腎功能。根據(jù)抗MICA抗體是否陽性分為抗MICA抗體(+)組和

16、抗MICA抗體(-)組。MICA抗體檢測(cè)采用液相芯片分析技術(shù)，在包被已知MICA抗原的熒光微球中加入患者血清，再加入R-藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的羊抗人IgG，重懸熒光微球，Luminex機(jī)上閱讀。使用DataCollectorVersion1.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以雙色激光分別讀取每個(gè)MICA抗原＞100個(gè)微球，經(jīng)分子PE熒光強(qiáng)度獲得cut-off分值，判讀出0、2、4、8，將OD值≥4定為抗MICA抗體陽性，并獲得MICA抗體特異性。采

17、集139例移植受者年齡、性別、術(shù)后免疫抑制方案、早期急性排斥反應(yīng)(AR)發(fā)生與否，術(shù)后7d內(nèi)的血肌酐及24小時(shí)尿量、移植腎功能恢復(fù)時(shí)間等資料，兩組間比較。AR抗排斥治療方案:給予甲基強(qiáng)的松龍(MP)沖擊治療，劑量為0.5g、0.25g、0.25g，連續(xù)3d。如果腎功能無明顯好轉(zhuǎn)或繼續(xù)惡化，使用環(huán)磷酰胺沖擊治療，療程3-5d，并血液透析過渡等綜合治療。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，

18、計(jì)數(shù)資料比較采用x2檢驗(yàn)、校正x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 已知MICA抗體情況的197例受者中有139例接受移植，均為尸體供腎，供受者ABO血型相同，術(shù)前淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)陰性。患者術(shù)后免疫抑制方案均為:抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)+他克莫司(Tacrolimus，Tac)+霉酚酸酯(Mycophenolate，MMF)+強(qiáng)的松(Pre

19、dnisone，Pred)。移植受者兩組間年齡、性別等因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。其中39例發(fā)生了早期AR(平均急排率28.1％)。45例MICA抗體陽性受者中有38例接受移植，其中14例發(fā)生了早期AR(急排率36.8％);152例MICA抗體陰性受者中有101例接受移植，其中25例發(fā)生早期AR（急排率24.8％）;MICA抗體陽性與MICA抗體陰性之間早期AR率差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。18例單特異性抗體受者中有4例發(fā)生早期AR

20、(急排率22.2％)，17例多特異性抗體受者中有7例發(fā)生早期AR（急排率41.2％），兩組急排率差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.46，P＞0.05)。而美國Zou等報(bào)道254例受者免疫抑制藥物有效濃度治療下的MICA抗體陽性率為13.4％，兩組間差異顯著(x2=6.867,P=0.009＜0.01)。
　　 參與術(shù)后隨訪的MICA抗體陽性受者共38例，其中7例因無法獲取病例血肌酐資料而導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失，已知資料31例MICA抗體陽性

21、受者術(shù)后1周內(nèi)血肌酐水平，參與術(shù)后隨訪的MICA抗體陰性受者101例，其中19例因無法獲得病例血肌酐資料而導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失，已知資料82例MICA抗體陰性受者術(shù)后1周內(nèi)血肌酐水平，兩組術(shù)后1周內(nèi)血肌酐比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.001，P=0.979＞0.05)，說明組別效應(yīng)在術(shù)后1周不同時(shí)間內(nèi)的對(duì)血肌酐的影響效應(yīng)相同（圖4.1，表4.1）;兩組時(shí)間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=216.053，P=0.000＜0.05)，說明術(shù)后不同時(shí)間的血

22、肌酐水平之間有差異。時(shí)間和組別無交互作用(F=0.797，P=0.363＞0.05)，提示組別差異不隨時(shí)間變化而變化，提示術(shù)后第7天兩組血肌酐之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。已知資料31例MICA抗體陽性受者術(shù)后1周內(nèi)尿量，因20例受者無法獲得病例尿量資料而導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失，已知資料81例MICA抗體陰性受者術(shù)后1周內(nèi)尿量，兩組術(shù)后1周內(nèi)尿量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.006，P=0.940＞0.05)說明組別效應(yīng)對(duì)術(shù)后1周內(nèi)尿量水平的影響相同（

23、圖4.2，表4.2）;兩組時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.654，P=0.000＜0.05)，說明術(shù)后不同時(shí)間的尿量水平有差異。時(shí)間和組別無交互作用(F=0.122，P=0.947＞0.05)，提示組別差異不隨時(shí)間變化而變化，提示術(shù)后第7天兩組尿量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 18例中9例無法獲得血肌酐數(shù)據(jù)導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失，已知資料9例單特異性抗體受者術(shù)后7d血CR(202.9±130.2)umol/L，17例中3例無法獲得血肌酐

24、資料導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失，已知資料14例多特異性抗體受者術(shù)后7d血CR（193.3±135.9）umol/L，兩組術(shù)后7d血CR比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.168，P=0.868＞0.05)已知資料9例單特異性抗體受者術(shù)后7d尿量(2752.8±594.6)mL，已知資料14例多種特異性抗體受者術(shù)后7d尿量（2838.1±698.0）mL，兩組術(shù)后7d尿量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.302，P=0.765＞0.05）;18例單特異抗體組中

25、6例無法獲取移植腎恢復(fù)時(shí)間資料，已知資料12例單特異性抗體組移植腎功能恢復(fù)時(shí)間為(14.0±14.2)天，17例多特異性抗體組移植腎功能恢復(fù)時(shí)間為（20.0±21.5）天，兩組移植腎功能恢復(fù)時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.842，P=0.407＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 等候腎移植受者術(shù)前MICA抗體陽性率22.84％。MICA抗體中抗MICA019抗體頻率65.7％。推測(cè)MICA019為人群分布中較常見基因

26、，是表現(xiàn)高頻率抗體的原因。MICA抗體單特異性與多特異性比例接近(51.4％vs48.6％)，提示MICA抗體的產(chǎn)生不是單一途徑，可能包含多種因素，說明應(yīng)對(duì)抗體產(chǎn)生途徑進(jìn)行深入探討。雖然MICA抗體陽性組與陰性組相比早期AR率之間差異無顯著性，但是移植受者術(shù)前MICA抗體陽性對(duì)增加移植后早期AR率(28.1％↑36.8％，24.8％↑36.8％)具有獨(dú)立的影響，早期AR率的增加幅度為8.7％～12％，具有臨床意義。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)重視腎