重組MICA08蛋白制備及其預(yù)存抗體對(duì)大鼠腎移植的影響.pdf

1、腎移植后隨著新型針對(duì)T細(xì)胞強(qiáng)效免疫抑制劑的廣泛聯(lián)合應(yīng)用，使急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)得到了很好的控制，也大大減少了早期移植腎的丟失。然而，近年研究表明移植腎長(zhǎng)期存活并沒(méi)有隨之得到很好改善，這使人們開(kāi)始重視HLA(Humanleukocyteantigen，HLA)抗體介導(dǎo)的急、慢性體液性排斥反應(yīng)對(duì)移植腎長(zhǎng)期存活的意義。盡管在抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)中，多數(shù)情況是由于HLA抗體的緣故，但在一些HLA抗體陰性的患者中也發(fā)生了腎移植失功，這表明除HLA抗體外

2、還存在其它抗體也介導(dǎo)移植腎失功。
　　 主要組織相容性復(fù)合物-Ⅰ類相關(guān)鏈A(MajorhistocompatibilitycomplexclassⅠ-relatedchainA，MICA)基因位于人第6號(hào)染色體的MHC-I類區(qū)域中，具有高度多態(tài)性，其編碼MICA分子表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞表面。功能上MICA分子不結(jié)合β2微球蛋白，缺乏與CD8受體特定結(jié)合的殘基，沒(méi)有抗原肽遞呈能力；其系通過(guò)與NKG2D(Naturalkillingcel

3、lsreceptorG2D，NKG2D)受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。NKG2D是為NK細(xì)胞活化性受體，除表達(dá)于NK細(xì)胞外，還表達(dá)在γδT、CD8+T細(xì)胞上。MICA分子與NKG2D結(jié)合后不僅能激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞毒性作用，分泌大量細(xì)胞因子及細(xì)胞毒介質(zhì)，造成移植物破壞；而且能促使B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)MICA抗體，參與體液免疫應(yīng)答。
　　 由于MICA分子通常不表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面，在腎移植時(shí)通常采用的淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)無(wú)法檢測(cè)到MICA抗體。近

4、年隨著MICA抗體檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，多個(gè)器官移植中心在移植受者、排斥反應(yīng)前、發(fā)生排斥反應(yīng)切除的移植物中及其洗脫液中都檢測(cè)到MICA抗體，使MICA抗體的體液免疫作用備受關(guān)注，成為移植免疫研究的熱點(diǎn)。一系列研究表明，MICA抗體與排斥反應(yīng)相關(guān)，對(duì)移植物的長(zhǎng)期存活存在負(fù)面效應(yīng)，這種負(fù)面效應(yīng)在HLA良好配型無(wú)或少量HLA抗體的受體中更為明顯。雖然有研究認(rèn)為MICA抗體可以通過(guò)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒途徑造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起移植物失功；但對(duì)MICA抗體

5、引起急、慢性排斥反應(yīng)的確切分子免疫作用機(jī)制及系統(tǒng)干預(yù)措施目前仍不十分清楚，也缺乏特異性MICA抗體介導(dǎo)的體液性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型相關(guān)方面研究。
　　 因此，我們?cè)O(shè)想采用蛋白重組技術(shù)制備具有免疫活性的重組MICA08蛋白免疫大鼠，建立預(yù)存特異性MICA抗體動(dòng)物模型。通過(guò)對(duì)預(yù)存特異性MICA抗體動(dòng)物進(jìn)行腎移植誘導(dǎo)建立特異性MICA抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)并觀察其對(duì)大鼠移植腎的影響，探討新型免疫劑利妥昔單抗在干預(yù)MICA抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)中的

6、價(jià)值。研究分三個(gè)部分：
　　 第一部分：應(yīng)用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備重組MICA08蛋白
　　 目的：應(yīng)用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞(Sf-9)中表達(dá)人MICA*008胞外結(jié)構(gòu)域。
　　 方法：采用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-MICA*008，并將其轉(zhuǎn)化到E．coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)座，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和測(cè)序鑒定后，獲得重組桿狀病毒Bacmid-MICA*008

7、；應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鎳柱親和層析純化、Westernblot和考馬斯亮蘭染色鑒定。
　　 結(jié)果：在重組病毒感染第四天后收集P3代病毒上清液，P3代上清液經(jīng)鎳柱親和層析純化，最后獲得純化重組MICA08蛋白量約為1.4-1.5mg/L。純化MICA08蛋白經(jīng)Westernblot和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，可見(jiàn)一條分子量約為37kDa的特異性條帶與目的蛋白大小相符。
　　 結(jié)論：應(yīng)用昆蟲-

8、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)重組人MICA08蛋白，為下步預(yù)存抗體模型的建立奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 第二部分顯微外科微血管吻合技能訓(xùn)練及大鼠原位腎移植模型建立
　　 目的：探討快速建立大鼠原位腎移植模型的顯微外科訓(xùn)練方法，為開(kāi)展腎移植基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：設(shè)計(jì)并實(shí)施循序漸進(jìn)式顯微外科訓(xùn)練項(xiàng)目，以快速突破微血管吻合技術(shù)瓶頸。訓(xùn)練項(xiàng)目包括鏡下紗布縫合、大鼠頸動(dòng)脈吻合、大鼠股血管吻合及大鼠尾動(dòng)脈吻合

9、訓(xùn)練。然后采用30例同系SD大鼠供體雙腎切除原位移植訓(xùn)練積累手術(shù)經(jīng)驗(yàn)，克服學(xué)習(xí)曲線；術(shù)中腎血管重建采用端端吻合法，尿路重建運(yùn)用膀胱瓣技術(shù)或輸尿管．輸尿管端端吻合。模型穩(wěn)定后，再行20例SD→Wistar大鼠異系移植建立急性排斥反應(yīng)模型，并將其隨機(jī)分排斥組和MMF治療組，MMF治療組給予MMF20mg/kg/d灌胃，×10d。在術(shù)后第3d、7d、14d、21d采血，行血清肌酐檢測(cè)。
　　 結(jié)果：通過(guò)2個(gè)月強(qiáng)化顯微外科培訓(xùn)，完成了2

10、00根以上微血管吻合練習(xí)，大鼠腎移植模型趨于穩(wěn)定，術(shù)后一周成活率達(dá)90％。在行20例異系移植中，平均手術(shù)時(shí)間為72.9±4.18min，平均熱缺血時(shí)間為25.4±1.63min。排斥組大鼠BCr在術(shù)后第三天開(kāi)始升高，而MMF組在術(shù)后14天開(kāi)始升高；兩組分別于術(shù)后第7天和術(shù)后21天達(dá)頂峰，與同系組相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：規(guī)范化化顯微外科培訓(xùn)可短期獲得顯微外科微血管吻合技能，縮短大鼠腎移植手術(shù)學(xué)習(xí)曲

11、線。對(duì)SD→Wistar大鼠進(jìn)行腎移植，可建立穩(wěn)定、可靠的急性排斥反應(yīng)模型。
　　 第三部分：預(yù)存特異性MICA抗體動(dòng)物模型的建立及其抗體對(duì)大鼠移植腎的影響
　　 目的：建立預(yù)存特異性MICA抗體動(dòng)物模型，探討預(yù)存特異性MICA抗體對(duì)大鼠移植腎的影響及其干預(yù)措施。
　　 方法：采用重組MICA08蛋白和P3代Sf9細(xì)胞免疫大鼠，建立預(yù)存特異性MICA抗體動(dòng)物模型。對(duì)預(yù)存特異性MICA抗體的大鼠進(jìn)行腎移植誘導(dǎo)MIC

12、A抗體體液免疫，并采用MMF和利妥昔單抗進(jìn)行干預(yù)。從血清抗體、肌酐及腎臟病理等角度分析預(yù)存MICA抗體對(duì)大鼠移植腎的影響和利妥昔單抗在抗體介導(dǎo)的體液排斥反應(yīng)中的干預(yù)作用。
　　 結(jié)果：在重組MICA08蛋白致敏的動(dòng)物中，術(shù)前特異性MICA抗體分值為2分，術(shù)后特異性MICA抗體滴度升高達(dá)6分，與術(shù)前相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在P3代Sf-9細(xì)胞致敏的動(dòng)物中，術(shù)前特異性MICA抗體為6分，術(shù)后MICA抗體滴度升高達(dá)8分，與

13、術(shù)前相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在利妥昔單抗干預(yù)組中，淋巴細(xì)胞CD20表型較術(shù)前明顯減低，與術(shù)前、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明利妥昔單抗對(duì)CD20表型的淋巴細(xì)胞具有很好清除作用。與MMF實(shí)驗(yàn)組相比，利妥昔單抗抑制術(shù)后特異性MICA抗體滴度升高效果不明顯。在采用MMF為基礎(chǔ)免疫抑制劑治療中，術(shù)后第14d預(yù)存MICA抗體組與普通對(duì)照組相比腎功能要差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示預(yù)存MICA抗體