腎移植急性排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白的鑒定及應(yīng)用評價.pdf

1、目的聯(lián)合運用Tricine-SDS-PAGE電泳、SELDI質(zhì)譜技術(shù)和Western-blot技術(shù)，鑒定腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者血清中的高表達(dá)蛋白，尋找能為腎移植急性排斥反應(yīng)的臨床早期診斷與治療提供可靠的、靈敏的實驗室參考指標(biāo)。
　　 方法利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(surface-enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectromet

2、ry，SELDI-TOF-MS)技術(shù)研究腎移植急性排斥組、穩(wěn)定存活組以及疾病對照組血清中蛋白質(zhì)組學(xué)的改變，發(fā)現(xiàn)一系列急性排斥反應(yīng)的相關(guān)蛋白。這些蛋白中質(zhì)荷比(mass charge ratio，M/Z)為11731和9285的兩個蛋白血清中含量較高。挑選M/Z11731蛋白含量高的標(biāo)本作為研究對象。利用Tricine-SDS-PAGE電泳技術(shù)分離純化蛋白、胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解、SELDI-TOF-MS技術(shù)分析蛋白消化產(chǎn)物、獲得蛋白的肽指

3、紋圖譜(peptides mass fingerprinting，PMF)，在Profound蛋白數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行比對。利用免疫印跡法(Western-blot)對鑒定出的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。進(jìn)一步檢測41份未經(jīng)SELDI-TOF-MS技術(shù)分析的急性排斥反應(yīng)和穩(wěn)定存活組的血清標(biāo)本，觀察兩組之間該蛋白是否存在顯著差異性。并利用ROC曲線分析該蛋白鑒別急性排斥反應(yīng)的診斷價值。
　　 結(jié)果經(jīng)SELDI-TOF-MS技術(shù)獲得PMF，所包含肽

4、段M/Z分別為：1043.93、1068.52、1079.05、1095.20、1157.53、1293.60、1538.60、1717.94、1843.18、2614.44、2893.64、3004.98、3021.00、3149.33、3371.73、3395.91、3838.97、4539.083。在Profound蛋白數(shù)據(jù)庫內(nèi)初步檢索得該蛋白為免疫球蛋白超家族的一員，Western-blot確認(rèn)其為β2-MG。檢測顯示急性排斥反

5、應(yīng)組標(biāo)本血清中β2-MG濃度明顯高于穩(wěn)定存活組，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。當(dāng)β2-MG含量大于3.545 mg/L時，判斷其為急性排斥反應(yīng)的敏感性和特異性分別達(dá)到90％和90.5％。腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)患者血清β2-MG增高明顯早于血清肌酐增高，也明顯早于臨床表現(xiàn)。
　　 結(jié)論聯(lián)合SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺和western-blot鑒定出M/Z11731蛋白為已知的β2-MG。實驗證明兩種技術(shù)結(jié)合鑒定未知蛋白