IDO基因表達(dá)在大鼠肝臟移植后急性排斥反應(yīng)中的作用.pdf

1、最近發(fā)現(xiàn)一類新的DC細(xì)胞(dendriticcells，樹突狀細(xì)胞)亞群，能夠高表達(dá)IDO酶(jndoleamine2，3-dioxygenase，吲哚胺2，3雙加氧酶)，加快組織局部色氨酸代謝，從而抑制T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致外周免疫耐受。這類DC細(xì)胞亞群在體外可以被IFNγ干擾素誘導(dǎo)ID0基因的表達(dá)。因此，上調(diào)DC細(xì)胞IDO基因可能成為一種誘導(dǎo)移植后免疫耐受的新策略。本實(shí)驗(yàn)主要研究大鼠肝臟移植后IDO基因表達(dá)與移植后免

2、疫的關(guān)系。在建立穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討三方面內(nèi)容：(1)大鼠肝臟移植后移植物中ID0基因表達(dá)和IDO酶活性的時(shí)相變化；(2)移植物中ID0基因表達(dá)和ID0+細(xì)胞比率與移植后急性排斥反應(yīng)嚴(yán)重程度的關(guān)系；(3)體外IFNY誘導(dǎo)DC細(xì)胞IDO基因表達(dá)在大鼠肝臟移植后急性排斥反應(yīng)中的治療作用。 本實(shí)驗(yàn)采用如下方法：利用RT-PCR、Western-blot以及定量Real-timePCR等分子生物學(xué)方法研究ID0基

3、因和蛋白的表達(dá)情況；利用抗IDOmAb免疫組化染色顯示移植肝內(nèi)IDO+細(xì)胞的細(xì)胞類型和部位；采用新建立的大鼠肝臟“微透析-HPLC”技術(shù)分析移植肝中IDO酶的在體活性；提取并純化供體大鼠脾臟DC細(xì)胞，體外IFNγ誘導(dǎo)DC細(xì)胞表達(dá)IDO基因后經(jīng)門靜脈回輸移植肝臟，以評(píng)價(jià)ID0+DC細(xì)胞對(duì)肝臟急性排斥反應(yīng)的治療作用。本研究將有助于提高對(duì)肝臟移植后免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，并可能為肝臟急性排斥反應(yīng)提供新的治療手段。 第一部分快速法切取供肝及改良

4、袖套技術(shù)建立大鼠原位肝臟移植模型 目的:以二袖套法為基礎(chǔ)，探討影響大鼠原位肝臟移植手術(shù)成功的因素，并進(jìn)行改良。方法:采用“快速法”切取供肝、改良的套管技術(shù)以及預(yù)防腹腔出血等三方面改進(jìn)措施，對(duì)220例大鼠施行原位肝臟移植手術(shù)。結(jié)果:供體手術(shù)時(shí)間平均21．6±1．95min，供肝修整時(shí)間平均23．1±1．61min，受體手術(shù)時(shí)間平均48．1±2．63min，無肝期為15．9±2．26min，手術(shù)成功率為94．1％(207／220)。

5、同品系移植(SD→SD)大鼠能長(zhǎng)期生存，3個(gè)月生存率為80．7％，異品系移植(wistar→SD)大鼠術(shù)后第7天發(fā)生程度不等的急性排斥反應(yīng)，隨后因排斥導(dǎo)致肝功能衰竭死亡，平均生存時(shí)間14.5天。結(jié)論:利用這種改良方法能夠建立穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型，簡(jiǎn)化了手術(shù)過程，提高了手術(shù)成功率和動(dòng)物長(zhǎng)期生存率。未經(jīng)抗排斥治療的異品系大鼠移植肝臟均發(fā)生了程度不等的急性排斥反應(yīng)，因此可以作為肝臟移植后急性排斥研究的良好模型。 第二部分大鼠肝臟

6、移植后移植物中IDO基因表達(dá)和IDO酶活性的時(shí)相變化 目的:了解IDO基因表達(dá)及ID0酶活性在大鼠肝臟移植后的時(shí)相變化，研究IDO與移植后免疫的關(guān)系，為進(jìn)一步研究IDO在移植后免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制提供思路。方法:1)假手術(shù)對(duì)照組(n=15)：SD大鼠開腹阻斷肝臟血供15分鐘，模擬無肝期。2)同品系移植組(n=15)：施行SD_SD大鼠原位肝臟移植術(shù)。3)異品系移植組(n=15)：施行Wistar→SD大鼠原位肝臟移植術(shù)。各組3只

7、動(dòng)物于術(shù)后第1天植入微透探針，利用“微透析．HPLC”(Microdialysis．HPLC)技術(shù)進(jìn)行肝臟IDO酶活性的在體監(jiān)測(cè)。另外采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝臟移植后第2、5、7、14天肝臟IDOmRNA水平。結(jié)果:假手術(shù)對(duì)照組術(shù)后無急性排斥反應(yīng)，相應(yīng)的IDO酶活性和IDO基因表達(dá)水平極低。同品系移植組排斥反應(yīng)相對(duì)較輕，相應(yīng)的ID0基因表達(dá)略升高，且持續(xù)時(shí)間較短，移植肝內(nèi)IDO酶活性稍增加。異品系移植組排斥反應(yīng)嚴(yán)重，相應(yīng)的ID0表達(dá)明

8、顯升高，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，移植肝內(nèi)ID0酶活性也顯著增加，因此色氨酸代謝加快，濃度降低，代謝產(chǎn)物犬尿氨酸濃度升高，并且在較長(zhǎng)時(shí)間(2周)保持較高水平。結(jié)論:大鼠原位肝臟移植后移植物IDO酶活性增加，IDO基因表達(dá)上調(diào)，提示IDO可能參與肝臟移植后免疫調(diào)節(jié)。本研究中建立的大鼠“肝臟微透析一HPLC”分析技術(shù)能夠長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)移植后肝臟IDO酶的在體活性，是評(píng)價(jià)IDO與肝臟移植后免疫關(guān)系的良好研究工具。 第三部分大鼠肝臟移植后IDO基因表

9、達(dá)與急性排斥反應(yīng)關(guān)系的研究 目的:在第二部分研究中發(fā)現(xiàn)了大鼠肝臟移植后IDO基因異常表達(dá)以及ID0酶活性顯著升高，提示IDO可能參與肝臟移植后免疫調(diào)節(jié)。但是尚不明確這種IDO基因上調(diào)的細(xì)胞類型及其與急性排斥反應(yīng)程度的關(guān)系。本研究利用ID0mAb免疫組化染色尋找肝臟移植后肝內(nèi)IDO+細(xì)胞，并通過計(jì)算IDO+細(xì)胞比率和Real．timePCR方法定量研究IDO與移植后急性排斥嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法:11異品系肝臟移植組(n=30)：W

10、istar大鼠供體肝臟移植到SD受體大鼠。21假手術(shù)組(n=10)：阻斷肝臟血供15分鐘，模擬肝臟移植組無肝期。術(shù)后第7天處死動(dòng)物，取肝臟標(biāo)本常規(guī)病理切片，根據(jù)Banff急性排斥標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排斥嚴(yán)重程度的分級(jí)。再行ID0免疫組化染色、RT-PCR、Western-blot和Real．tiemPCR檢測(cè)。結(jié)果:首次發(fā)現(xiàn)了一類肝臟移植后IDO+細(xì)胞。它們主要分布于肝臟匯管區(qū)，形態(tài)類似于單核細(xì)胞，胞漿呈棕色染色。IDO+細(xì)胞比率隨急性排斥反應(yīng)程度

11、加重而成倍增高，IDO基因表達(dá)和ID0蛋白水平也相應(yīng)增加。定量PCR結(jié)果提示肝臟IDOmRNA拷貝數(shù)也隨排斥反應(yīng)加重而成倍增加。結(jié)論:ID0基因表達(dá)隨急性排斥反應(yīng)加重而上調(diào)，提示肝臟移植后IDO基因的異常表達(dá)是由于急性排斥反應(yīng)的發(fā)生引起的。而IDO+細(xì)胞主要在匯管區(qū)浸潤(rùn)，形態(tài)類似于單核細(xì)胞，其比率隨排斥反應(yīng)加重而增高，提示IDO+細(xì)胞可能作為一種特殊類型的致耐受DC細(xì)胞亞群參與移植后的免疫調(diào)節(jié)。 第四部分體外IFNγ誘導(dǎo)DC細(xì)胞

12、IDO基因表達(dá)在大鼠肝臟移植后急性排斥反應(yīng)中的治療作用 目的:通過上調(diào)DC細(xì)胞IDO基因表達(dá)，研究其抗肝臟移植排斥和誘導(dǎo)免疫耐受的能力。方法:IFNγ-DC組(n=21)：提取供體大鼠脾臟DC細(xì)胞體外培養(yǎng)，IFNγ上調(diào)DC細(xì)胞IDO基因的表達(dá)，于移植后第1天將這種ID0+IFγ-DC細(xì)胞經(jīng)門靜脈注射回輸受體大鼠。DC組(n=21)：于移植后第1天將未經(jīng)IFNγ處理的DC細(xì)胞經(jīng)門靜脈回輸受體大鼠。結(jié)果:IFNγ-DC組大鼠較DC組

13、急性排斥癥狀明顯減輕，肝功能恢復(fù)良好，生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，病理顯示匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，排斥反應(yīng)輕。IFNγ-DC門靜脈回輸受體大鼠后，在移植后早期移植肝內(nèi)IDO基因水平和IDO酶活性顯著上調(diào)，此后隨急性排斥反應(yīng)的控制而逐漸降低。而DC組急性排斥癥狀重，肝功能進(jìn)行性惡化，動(dòng)物生存時(shí)間縮短，病理顯示II～I(xiàn)II級(jí)排斥反應(yīng)。DC門靜脈回輸受體大鼠后，在移植后早期肝內(nèi)ID0基因水平和IDO酶活性均較低，此后隨急性排斥反應(yīng)加重而逐漸升高，并持續(xù)

14、高表達(dá)較長(zhǎng)時(shí)間(2周以上)。TUJNEL法檢測(cè)IFNγ-DC組肝臟匯管區(qū)T細(xì)胞凋亡增加，F(xiàn)ACS檢測(cè)外周血中CD4+T細(xì)胞凋亡也增加，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞分泌的IFNγ細(xì)胞因子相對(duì)減少，Th2分泌的IL4、IL．10等細(xì)胞因子相對(duì)增多。結(jié)論:IFNγ誘導(dǎo)后ID0+DC細(xì)胞具有一定的抗急性排斥反應(yīng)的作用，可能通過表達(dá)IDO酶催化局部色氨酸代謝，促進(jìn)T細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞因子免疫偏離等機(jī)制導(dǎo)致肝臟移植后免疫耐受。這為