慢病毒介導RNAi沉默survivin在口腔鱗狀上皮細胞癌基因治療中的實驗研究.pdf

1、慢病毒介導RNAi沉默survivin在口腔鱗狀上皮細胞癌基因治療中的實驗研究口腔鱗狀上皮細胞癌(oralsquamouscellcarcinoma，OSCC)是最常見口腔腫瘤，導致死亡人數居口腔疾病之首。應用手術、放療和化療等方法并不能有效提高OSCC患者生存率。特別是化療過程中產生的多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)現象增加了治療難度。因此OSCC發(fā)病機制及高效治療手段特別是基因治療的研究對患者生存率的提高十

2、分迫切。 由于細胞周期調控基因突變或高表達，腫瘤細胞周期常出現異常改變。目前細胞凋亡是腫瘤研究熱點之一。凋亡抑制一方面可導致腫瘤發(fā)生發(fā)展，另一方面也造成腫瘤細胞對放、化療耐受。Survivin是凋亡抑制家族成員，表達于胚胎組織；除弱表達于胎盤、睪丸、胸腺等組織外，其它終末成熟分化組織均未檢出；與正常組織相反，survivin幾乎在所有人類腫瘤組織不同程度表達。Survivin不僅可抑制腫瘤細胞凋亡，而且參與調節(jié)細胞周期，促進細胞

3、分裂增殖。 研究發(fā)現，survivin也在OSCC表達。并且我們實驗表明，在非P糖蛋白介導MDR的OSCC細胞株C-A120中，survivin表達水平顯著高于敏感前體株KB細胞。凋亡信號通路阻斷可導致MDR現象，因此survivin高表達可能是C-A120細胞MDR機制之一。另有研究指出survivin還可促進DNA雙鏈斷裂修復，在腫瘤放療耐受中同樣發(fā)揮重要作用。因此，survivin可能是逆轉C-A120細胞MDR、提高OS

4、CC放、化療敏感性的理想基因治療靶點。 口腔腫瘤的基因治療在臨床試驗中仍處于探索階段?；蛑委煹呐R床應用及其效果依賴于載體系統(tǒng)的優(yōu)化及轉染效率的提高。研究提示以慢病毒為載體的基因沉默具有較好應用前景。慢病毒可感染分裂期與非分裂期細胞，且在靶細胞內穩(wěn)定表達，作為基因載體應用了近10年，但在腫瘤基因治療中的研究未充分開展。 本實驗構建慢病毒RNA干擾(RNAinterference，RNAi)載體，抑制survivin基因，

5、研究其逆轉MDR、提高放、化療敏感性作用，初步探討慢病毒介導survivin沉默在口腔腫瘤基因治療中的應用前景。 方法與結果：第一部分慢病毒介導RNAi沉默survivin逆轉多藥耐藥及增強放射敏感性方法：構建靶向survivin的慢病毒RNAi載體，體外轉染OSCC多藥耐藥細胞株C-A120。應用半定量RT-PCR與Westernblot檢測基因沉默效果；MTT方法分析細胞對化療藥物敏感性；克隆形成試驗檢測放射敏感性；彗星試驗

6、探討survivin是否促進DNA雙鏈斷裂修復。 結果：RNAi慢病毒轉染細胞后，survivin在mRNA及蛋白質水平被顯著、持久沉默；C-A120細胞對阿霉素(adriamycin，ADM)及長春新堿(vincristine，VCR)的IC50值分別從2.27、154.21降低至1.61、57.88，耐藥倍數從12.64、110.94分別降至7.32、41.64(P＜0.05)，而轉染對照慢病毒的細胞未見明顯變化；另外C-A

7、120細胞對放射敏感性也顯著增加，X射線劑量為8Gy時，克隆形成率僅為0.02％，低于KB細胞的0.047％(P＜0.05)；從彗星試驗結果看出，經X射線照射后，survivin沉默后的C-A120細胞彗星尾長為26.30±3.14μm，明顯長于對照組的尾長14.48±2.19μm(P＜0.05)，提示survivin可促進DNA雙鏈斷裂修復。 第二部分慢病毒介導RNAi沉默survivin治療口腔鱗狀上皮細胞癌實驗研究方法：構

8、建靶向survivin的慢病毒RNAi載體，體外轉染口腔鱗狀上皮細胞癌KB細胞株，繪制細胞生長曲線，流式細胞術檢測自發(fā)及藥物誘導凋亡率，MTT試驗分析藥物敏感性，克隆形成試驗檢測放射敏感性。動物實驗檢測慢病毒移植瘤體內局部注射對腫瘤的生長抑制作用。 結果：慢病毒沉默KB細胞survivin后，細胞生長在第5天下降了34.2％(P＜0.05)；長春新堿誘導細胞凋亡率顯著升高29.8％(P＜0.05)；MTT試3驗表明阿霉素IC50

9、值為0.09μg/ml，藥物敏感性是對照組2.1倍(P＜0.01)；克隆形成率在劑量為6Gy的X射線時為3.7％，比對照組15.3％明顯降低(P＜0.05)。動物實驗表明，慢病毒沉默survivin后可抑制KB細胞體內成瘤過程，第35天腫瘤體積僅為1.52±0.36cm3，小于空白對照組的2.41±0.80cm3及對照慢病毒組的2.64±0.71cm3(P＜0.05)。同時慢病毒局部注射能有效抑制腫瘤組織生長，第25天腫瘤體積為2.49

10、±0.56cm3，小于生理鹽水組的3.67±0.67cm3及對照慢病毒組的3.42±0.74cm3(P＜0.05)。另外聯(lián)合應用慢病毒還可以進一步提高化療藥物長春新堿的抗腫瘤效果，第25天腫瘤體積為1.54±0.39cm3，生理鹽水組為2.87±0.55cm3，單獨應用長春新堿組為1.97±0.57cm3；但生存分析結果表明慢病毒聯(lián)合長春新堿組平均生存時間與生理鹽水組、單獨應用長春新堿組比較并無顯著性差異。 結論：慢病毒介導RN