雜色曲霉素對(duì)食管鱗狀上皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：雜色曲霉素(sterigmatocystin，ST)是致癌性真菌毒素，是我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中的主要污染真菌毒素之一。本研究室以往研究發(fā)現(xiàn)，采用河北省太行山區(qū)居民正在使用的酸菜湯樣品、雜色曲霉菌素污染的玉米面以及純化的雜色曲霉素灌胃的動(dòng)物誘癌實(shí)驗(yàn)研究中，可以見(jiàn)到肺腺癌和胃不典型增生，但均未發(fā)現(xiàn)誘發(fā)食管癌。雜色曲霉素作為食管癌的病因尚缺乏足夠的證據(jù)。 機(jī)體的免疫功能狀態(tài)是影響腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素，惡變細(xì)胞可通過(guò)多種機(jī)制

2、逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)障礙而無(wú)法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和殺傷。本研究室以往研究證實(shí)，ST可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞(humanperipheralbloodmononuclearcell，HPBMc)中的淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，并在一定時(shí)間(2～48小時(shí))和劑量(0.125～2.0mg/L)范圍內(nèi)呈正相關(guān)，對(duì)HPBMc細(xì)胞表面HLA-Ⅰ分子表達(dá)呈劑量依賴性下降。 有研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)食管癌組織與正常組織相比，HLA-Ⅰ

3、表達(dá)下降，并且HLA-Ⅰ的下調(diào)與病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。為了從免疫方面進(jìn)一步探討ST在食管癌發(fā)生中的可能作用，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)： 1應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)方法研究了ST對(duì)體外培養(yǎng)的人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)的影響。 2為探討ST處理食管鱗狀上皮HLA-Ⅰ表達(dá)影響的可能機(jī)制用細(xì)胞培養(yǎng)、WestonBolt和RT-PCR相結(jié)合的辦法，研究了ST對(duì)體外培養(yǎng)的人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1、LMP2表達(dá)的影響。

4、 3為探討食管異常情況下，ST對(duì)食管鱗狀上皮致癌的可能作用，應(yīng)用病理觀察、免疫組化和原位雜交的方法研究了ST處理反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮PCNA、TAP1、LMP2蛋白和TGFβ2mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：1雜色曲霉素對(duì)人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明，HLA-Ⅰ陽(yáng)性反應(yīng)定位于體外培養(yǎng)食管上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。各實(shí)驗(yàn)組每高倍視野平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果分別為空白對(duì)照，13.4

5、7±7.08、溶媒對(duì)照14.51±5.68、ST濃度從0.125mg/L至2.0mg/L分別為16.37±6.30、15.80±8.00、8.14±4.90、7.81±4.60、3.84±0.97；FCM定量檢測(cè)細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)情況分別為空白對(duì)照，1.0320±0.0096、溶媒對(duì)照1.0267±0.013、ST濃度從0.125mg/L至2.0mg/L分別為1.0200±0.0227、1.012±0.0104、0.994±0.0108

6、、0.973±0.0108、0.957±0.0136。免疫組化結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時(shí)后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 FCM檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時(shí)后，較低濃度處理組(0.12

7、5、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時(shí)后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA

8、-Ⅰ表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2雜色曲霉素對(duì)人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1和LMP2表達(dá)的影響 WestonBlot半定量檢測(cè)TAP1和LMP2蛋白量表達(dá)結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時(shí)后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1和LMP2蛋白表達(dá)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1和LMP2蛋白

9、表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 同樣，半定量RT-PCR檢測(cè)TAP1和LMP2mRNA表達(dá)結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時(shí)后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1和LMP2mRNA表達(dá)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1和LMP2mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3雜色曲霉素對(duì)反流性食管炎大

10、鼠食管鱗狀上皮PCNA、TAP1LMP2蛋白和TGFβ2mRNA表達(dá)的影響 賁門括約肌部分切除術(shù)加幽門半結(jié)扎術(shù)可成功制備反流性食管炎模型。所有模型組和處理組都出現(xiàn)食管炎的表現(xiàn)，鏡下主要以炎癥和增生為主，有潰瘍形成。光鏡下炎癥評(píng)分，處理組與模型組比較，雖然炎癥評(píng)分略增高，但各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡下增生程度評(píng)分結(jié)果，處理組與模型組比較，增生程度評(píng)分增高，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 PCNA陽(yáng)性表達(dá)于反流性食管炎大鼠食

11、管上皮細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。對(duì)照組表達(dá)PCNA增殖指數(shù)為21.50±9.79；模型組PCNA增殖指數(shù)為49.17±18.67；處理組PCNA增殖指數(shù)為70.10±12.55。ST處理組與模型組、對(duì)照組比較PCNA指數(shù)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 TAP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)于反流性食管炎大鼠食管上皮細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。對(duì)照組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為71.17±6.62；模型組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為36.17±5.31；處理組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為2

12、0.83±7.08。模型組和ST處理組表達(dá)明顯降低，尤處理組降低明顯。ST處理組與模型組、對(duì)照組比較TAP1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 LMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)于反流性食管炎大鼠食管上皮細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。LMP2陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。對(duì)照組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為53.83±5.81；模型組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為34.50±6.44；處理組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為22.50±6.72。ST處理組與模型組、對(duì)照組比較LMP2蛋

13、白陽(yáng)性表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 TGFβ2mRNA陽(yáng)性表達(dá)于反流性食管炎大鼠食管上皮細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。對(duì)照組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為19.33±5.28；模型組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為53.17±6.77；處理組，平均陽(yáng)性細(xì)胞率為80.00±10.71。ST處理組與模型組、對(duì)照組比較TGFβ2mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1.在0.125mg/L到2mg/L濃度范圍內(nèi)，ST可劑量依賴地抑制體外培養(yǎng)人食管

14、鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ的表達(dá)。 2.在0.125mg/L到2mg/L濃度范圍內(nèi)，ST可劑量依賴地抑制體外培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細(xì)胞TAP1、LMP2在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)。 3.ST處理后體外培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)下降和TAP1、LMP2表達(dá)下降密切相關(guān)。 4.賁門括約肌部分切除術(shù)加幽門半結(jié)扎術(shù)可成功制備大鼠反流性食管炎模型。 5.經(jīng)腹腔給予ST處理可明顯增加反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮的

15、增殖活性和增生程度。 6.經(jīng)腹腔給予ST處理可明顯降低反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮TAP1及LMP2在蛋白水平上的表達(dá)。 7經(jīng)腹腔給予ST處理可增強(qiáng)反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮TGFβ2mRNA表達(dá)。 綜合結(jié)果表明，雜色曲霉素處理可降低體外培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ表達(dá)，其機(jī)制可能與TAP1、LMP2表達(dá)下降有關(guān)。經(jīng)腹腔給予ST處理可促進(jìn)反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮的增殖活性和增生程度，同時(shí)降低食管鱗狀上皮