雜色曲霉素對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：雜色曲霉素(sterigmatocystin，ST)是致癌性的真菌毒素，是雜色曲霉(Aspergillus versicolor)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)等真菌產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物。在糧食和飼料中的污染非常普遍，甚至在潮濕居所的地毯灰塵中也可檢出雜色曲霉素的污染。研究表明，在我國食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中ST也是主要污染霉菌毒素之一。 本研究采用半定量RT-PCR方法探討了腹腔注射ST對(duì)小鼠外周血單

2、個(gè)核細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的。TNF-α、IL-6和IL-12在mRNA水平的影響，并用ELISA方法研究ST對(duì)小鼠血清中INF-a及IL-6含量的影響，旨在從免疫角度探討我國食管癌高發(fā)區(qū)糧食中常見優(yōu)勢(shì)污染霉菌毒素-ST對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的可能影響，揭示ST的暴露在我國食管癌高發(fā)區(qū)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用。 方法： 1實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物處理選用健康雄性BALB/c小鼠96只，隨機(jī)分為3組，分別為ST處理組、溶劑對(duì)照組和對(duì)照組。按

3、照處死時(shí)間的不同，又將上述各組分為2h、6h、12h和24h四組。各ST處理組小鼠均經(jīng)腹腔單次注射ST3000μg/kg，溶劑對(duì)照組和對(duì)照組動(dòng)物分別腹腔注射同等容量的溶劑(DMSO生理鹽水溶液)和生理鹽水。 2小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離小鼠摘眼球取血，用3.2％檸檬酸三鈉(Na3C8H5O7.2H2O)抗凝，采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞。 3小鼠血清的制備小鼠摘眼球取血，待血凝固后離心取上清

4、，-80℃保存?zhèn)溆谩?4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離將小鼠眼球放血處死后，浸泡于75％酒精，用10ml冰冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗腹腔，無菌收集腹腔滲出細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按5×106cells/mL接種于含105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2培養(yǎng)2小時(shí)以使巨噬細(xì)胞貼壁。 5細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。1％瓊脂糖電泳鑒定其完整

5、性。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。 6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)檢測(cè)ST在不同處理時(shí)間對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞及腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-12 mRNA表達(dá)的影響。采用凝膠分析軟件(BIO-LD)對(duì)凝膠進(jìn)行定量，各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH量的比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。 7 ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子的水平采用晶美生物工程(北京)有限公司的小鼠TNF-α、IL-6定量試劑盒，檢測(cè)ST處理不

6、同時(shí)間對(duì)小鼠外周血中TNF-α和IL-6水平的影響。 8統(tǒng)計(jì) 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析與單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，數(shù)據(jù)用x±s表示。 結(jié)果： 一 ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-12mRNA表達(dá)的影響 1.ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)的影響RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳及定量分析表明，與

7、生理鹽水對(duì)照組相比，各溶劑對(duì)照組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯不同。ST 2h、6h、12h和24h處理組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.04，0.16±0.04，0.21±0.06和0.22±0.05，均明顯低于其對(duì)應(yīng)的溶劑對(duì)照組(0.38±0.03，0.41±0.03，0.42±0.05和0.37±0.06，P＜0.01)，其中以ST 6h處理組TNF-α mRNA的表達(dá)降低最明顯(P＜0

8、.05)。 2.ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響半定量RT-PCR檢測(cè)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6 mRNA水平的結(jié)果表明，IL-6 mRNA的表達(dá)在各生理鹽水對(duì)照組與溶劑對(duì)照組細(xì)胞之間無明顯差異。而ST處理組與其相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較IL-6 mRNA的表達(dá)均有一定差異，隨ST處理時(shí)間不同對(duì)IL-6 mRNA的表達(dá)影響也不同。ST 2h、6h處理組IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.75±0.09，1.38

9、±0.20)均高于溶劑對(duì)照組(0.54±0.13，0.48±0.08，P＜0.01)。但ST 12h、24h處理組表達(dá)呈降低趨勢(shì)，ST 24h處理組的相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.05，明顯低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組(0.55±0.09，P＜0.01)。 3.ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-12 mRNA表達(dá)的影響與生理鹽水對(duì)照組相比，各溶劑對(duì)照組細(xì)胞IL-12p35mRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯不同。ST 2h、6h、12h和24h處理組IL

10、-12p35 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.33±0.06，0.29±0.07，0.30±0.04和0.35±0.05，均明顯低于相應(yīng)溶劑對(duì)照組(0.66±0.10，0.69±0.13，0.71±0.05，0.73±0.16，P＜0.01)。但在ST處理組之間其表達(dá)無明顯改變。 在空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、ST處理組均未檢到小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-12p40 mRNA的表達(dá)。 二 ST對(duì)小鼠外周血血清中TNF-α和IL-

11、6水平的影響 1.ST對(duì)小鼠血清中TNF-α水平的影響ELISA檢Nd,鼠血清中TNF-α水平的結(jié)果表明，ST2h、6h、12h、24h處理組與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組的TNF-α水平{(11.43±0.60)、(12.17±1.04)、(11.69±1.53)、(12.43±1.40)pg/ml}相比，TNF-α水平均明顯降低(P＜0.01)。ST 2h和6h處理組TNF-α血清水平分別為(9.14±0.58)pg/ml和(8.57±

12、0.57)pg/ml，而在ST 12h和24h處理組均未檢測(cè)到TNF-α。ST處理組小鼠血清中TNF-α水平，隨時(shí)間的延長而逐漸降低，二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.905，P＜0.01)。 2.ST對(duì)小鼠血清中IL-6水平的影響ELISA檢Nd,鼠血清中IL-6水平的結(jié)果表明，ST2h、6h、12h、24h處理組與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組{(10.63±1.58)，(11.63±1.52)，(12.25±1.26)，(10.90±1.14)p

13、g/ml}相比，IL-6水平均明顯降低(P＜0.01)。在ST 2h和6h處理組IL-6的水平分別為(7.32±1.10)pg/ml和(7.00±1.00)pg/ml，ST12h和24h處理組均未檢測(cè)到IL-6蛋白的分泌。ST處理組小鼠血清中IL-6水平隨時(shí)間的延長而逐漸降低(r=-0.933，P＜0.01)。 三ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6及IL-12 mRNA表達(dá)的影響 1.ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF

14、-α mRNA表達(dá)的影響RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳及定量分析表明，各溶劑對(duì)照組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比無差異。ST 2h、6h、12h、24h處理組TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量依次為0.37±0.08，0.34±0.06，0.15±0.01，0.13±0.03，均明顯低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組(0.51±0.06，0.52±0.04，0.54±0.10，0.53±0.10，P＜0.05

15、)。ST處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)隨時(shí)間的延長逐漸降低(r=-0.833，P＜0.01)。 2.ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響與生理鹽水對(duì)照組相比，各溶劑對(duì)照組細(xì)胞IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯改變。不同時(shí)間ST處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均比相應(yīng)的溶劑對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，但各ST處理組間IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.ST

16、對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12 mRNA表達(dá)的影響IL-12p35 mRNA相對(duì)表達(dá)量在溶劑對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組之間沒有明顯變化。各ST處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12p35 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均較其相應(yīng)的溶劑對(duì)照組顯著降低。 在空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、ST處理組均未檢測(cè)到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12p40 mRNA的表達(dá)。 結(jié)論： 1單次給予小鼠腹腔注射ST 3000ug/kg后，在2-24h范圍內(nèi)ST對(duì)小鼠外

17、周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)主要為抑制作用，其中以6h處理組的抑制最為顯著。 2.ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響隨處理時(shí)間的不同而不同，在處理2h和6h，ST對(duì)IL-6 mRNA的表達(dá)具有一定的誘導(dǎo)作用，而隨著ST處理時(shí)間延長至24h，表現(xiàn)為明顯的抑制作用。 3.ST可以顯著抑制小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-12p35 mRNA表達(dá)。 4 ST可以降低小鼠外周血血清中TNF-α及I