雷帕霉素對改良的EAM小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子影響的研究.pdf

1、人類特發(fā)性炎性肌?。↖IM）是一組異質(zhì)性的骨骼肌炎性疾病，以肌肉無力和炎細(xì)胞浸潤肌纖維表現(xiàn)為特征。既往研究表明它是一組自身免疫性疾病，然而，由于該病的確切病因和發(fā)病機(jī)制知道甚少，并且糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的治療雖有部分療效，但有很多副作用。
　　為解決這個(gè)問題，建立一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（EAM）動(dòng)物模型一直被探索著。在以往的研究中應(yīng)用肌溶漿、部分提純的的骨骼肌肌球蛋白、C-蛋白、C-蛋白的第二片段(SC2)、轉(zhuǎn)基因鼠誘導(dǎo)

2、EAM動(dòng)物模型，都存在不同程度的方法復(fù)雜、耗時(shí)、肌炎輕、重復(fù)性差和低成功等缺點(diǎn)。因此，在本研究中，我們對傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良，通過增加肌球蛋白的量和百日咳毒素（PT）的接種次數(shù)，成功建立了省時(shí)、重復(fù)性好的EAM動(dòng)物模型。
　　IIM是一種自身免疫性疾病。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在免疫抑制中起重要作用，提高其數(shù)量和功能可避免自身免疫性疾病的發(fā)生。以往研究表明糖皮質(zhì)激素和雷帕霉素（Rapa）等能增加Treg數(shù)量，并且甲潑尼龍琥珀酸鈉（下

3、文簡稱甲強(qiáng)龍）治療IIM有效，因此，以甲強(qiáng)龍治療為對照，評估雷帕霉素的療效。
　　目的：
　　建立一種省時(shí)、高效、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎動(dòng)物模型，為研究人類IIM提供實(shí)驗(yàn)工具。評估雷帕霉素對EAM療效及其對Treg的影響，初步了解EAM的發(fā)病機(jī)制，為人類IIM提供新的治療策略。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：豚鼠的肌漿球蛋白分別用兩種方法誘導(dǎo)EAM動(dòng)物模型，比較其建模效果。48只BALB/c小鼠被隨機(jī)分為3組，傳

4、統(tǒng)模型組、改良模型組和輔劑對照組，各組16只。傳統(tǒng)模型組：CFA+1mg肌球蛋白，免疫4次，PT注射1次；改良模型組：CFA+1.5mg肌球蛋白，免疫2次，PT注射2次；輔劑對照組：CFA+生理鹽水,免疫2次，PT注射1次。在最后一次免疫后10天，比較組間在肌力、脾臟外觀、肌酸激酶、肌電圖、病理和免疫組織化學(xué)方面的差異。
　　實(shí)驗(yàn)二：20只BALB/c小鼠被隨機(jī)分為4組：正常組、EAM組（改良模型組）、甲強(qiáng)龍干預(yù)組，雷帕霉素干預(yù)組

5、，各組5只。正常組：未進(jìn)行任何處理。模型組：按改良模型組的方法建立模型，在最后一次免疫后10天，觀測。甲強(qiáng)龍和雷帕霉素干預(yù)組:按模型組方法建立動(dòng)物模型，在最后一次免疫后10天，開始分別給予甲強(qiáng)龍和雷帕霉素，連續(xù)腹腔注射14天，干預(yù)結(jié)束次日，進(jìn)行以下方面的觀測：肌力、脾臟外觀、病理和免疫組織化學(xué)染色、血清細(xì)胞因子、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定脾臟淋巴細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)及肌肉和脾臟中Foxp3的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　實(shí)

6、驗(yàn)一：三組肌力均下降，傳統(tǒng)組、改良組和對照組肌力分別是55.05±7.27S、22.81±9.28S、98.16±13.79S；（三組間P≤0.01)；傳統(tǒng)組、改良組和對照組肌酸激酶分別是2526.77±930.22u/L、2618.19±640.35u/L、1161.69±267.98u/L，（兩模型組間P＞0.05，模型與對照組P≤0.01)；肌電圖的測量，模型組比對照組明顯的持續(xù)時(shí)間短，振幅低，（未做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理）；傳統(tǒng)組、改良組和

7、對照組組織學(xué)得分分別是：2.45±0.73、2.51±0.61、0.47±0.31，（兩模型組間P＞0.05，模型與對照組P≤0.01)；模型組免疫組織化學(xué)染色顯示MHC-I過表達(dá)在一些纖維中但不彌散，CD8+T細(xì)胞主要位于肌內(nèi)膜，部分浸潤非壞死的肌纖維，盡管有大量的CD4+T細(xì)胞在肌內(nèi)膜，相對少量的CD4+T細(xì)胞浸潤肌纖維，這些發(fā)現(xiàn)僅存在于模型組，而對照組沒發(fā)現(xiàn)。
　　實(shí)驗(yàn)二：正常、EAM、甲強(qiáng)龍和雷帕霉素干預(yù)組肌力分別是＞30

8、min、20.50±2.27S、88.13±4.77S、102.20±7.83S，（組間P≤0.01）；正常組脾臟體積小、光滑紅潤；模型組脾臟明顯增大并有粘連，而干預(yù)組脾臟則介于正常與模型組之間；正常、EAM、甲強(qiáng)龍和雷帕霉素干預(yù)組組織學(xué)得分分別是0、2.22±0.12、1.72±0.16和1.28±0.19，（組間P≤0.05）；FCM檢測脾細(xì)胞Treg表達(dá)比例分別是正常組3.7±0.34％、模型組12.52±1.71％、甲強(qiáng)龍組5.

9、65±0.83％、雷帕霉素7.08±0.56％；液態(tài)芯片技術(shù)檢測血清細(xì)胞因子TGF-B1和IL-10分別是正常組1046.75±82.01和4.58±0.93、模型組2087.00±74.27和15.36±0.50、甲強(qiáng)龍組2238.50±134.29和.2.82±0.33、雷帕霉素組2501.75±329.11和2.39±0.32（正常組與甲強(qiáng)龍組P＞0.05；甲強(qiáng)龍與雷帕霉素組P＞0.05）；肌肉和脾臟中Foxp3的mRNA水平分別

10、是正常組2.76±0.47和94.94±7.13、模型組0.38±0.10和16.44±2.19、甲強(qiáng)龍組2.46±0.36和100.85±8.75、雷帕霉素組0.99±0.02和233.24±8.17（甲強(qiáng)龍與雷帕霉素組P＞0.05，其它組間P≤0.01）。
　　結(jié)論：
　　1．通過增加肌球蛋白的免疫劑量和百日咳毒素注射次數(shù)，我們成功誘導(dǎo)了確切可靠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎動(dòng)物模型，其在基本的病理方面類似于人類的PM和DM。在

11、本研究中，我們花了傳統(tǒng)方法的一半時(shí)間，而得到更好的致炎效果，這個(gè)動(dòng)物模型對研究特發(fā)性炎性肌病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展特異性的治療提供有用的工具。
　　2．雷帕霉素對EAM有明顯的治療作用，應(yīng)用雷帕霉素2周，EAM小鼠在體重、肌力和組織學(xué)方面改善明顯，效果優(yōu)于甲強(qiáng)龍。因此，Rapa是治療炎性肌病很有應(yīng)用前景的候選藥物。
　　3．它可以使脾臟中Foxp3的mRNA表達(dá)增加；同時(shí)血清中TGF-β1升高，而IL-10接近正常；而外周淋巴器官