雷帕霉素及環(huán)孢素對人類調節(jié)性T細胞增殖影響的實驗研究.pdf

1、目的：體外提取培養(yǎng)人類外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)，并驗證其免疫抑制功能;分別觀察雷帕霉素及環(huán)孢素對CD4+CD25+Treg細胞體外增殖的影響，初步探討其可能機制。
　　 方法：本實驗分為兩部分:第一部分，人類外周血CD4+CD25+Treg細胞的體外提取培養(yǎng)及功能驗證:取新鮮健康成人外周血50～100mL，利用密度梯度離心法得到外周血單核細胞，然后使用人類CD4+CD2

2、5+CD127dim/-T細胞分離試劑盒Ⅱ，通過免疫磁珠法進一步提取得到CD4+CD25+Treg細胞，利用流式細胞儀檢測CD4、CD25雙陽性細胞純度，然后取一部分細胞進行羧基熒光素乙酰乙酸染色，連同未經(jīng)染色細胞分別轉移至96孔板內進行培養(yǎng)，添加含CD3/CD28單克隆抗體所包被的磁珠及高濃度重組人IL-2等的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37.5℃、飽和濕度、5％CO2濃度條件下進行培養(yǎng)，7天后將染色細胞進行流式細胞儀檢測明確其增

3、殖情況，其余未染色CD4+CD25+Treg細胞繼續(xù)培養(yǎng)7天，定期更換培養(yǎng)基，進行細胞計數(shù)及細胞傳代;將免疫磁珠法陽性選擇中所保留的CD4+CD25-T細胞（效應性T細胞）用羧基熒光素乙酰乙酸標記后與同種同體CD4+CD25+Treg細胞1∶1混合培養(yǎng)7天，然后經(jīng)流式細胞儀檢測觀察分析CD4+CD25-T細胞的受抑制情況;笫二部分，雷帕霉素及環(huán)孢素對人體外周血CD4+CD25+Treg細胞體外增殖的影響:將提取所得CD4+CD25+Tr

4、eg細胞全部進行羧基熒光素乙酰乙酸標記，然后將細胞分成三組，每組至少設置3個復孔進行培養(yǎng)，在加入上述培養(yǎng)基的基礎上，第一組添加濃度為100nmol/L的雷帕霉素試劑，第二組添加濃度為410nmol/L的環(huán)孢素試劑，第三組為空白對照組，不添加任何其他試劑。三組細胞于相同環(huán)境下培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基并添加相應試劑，7天后進行流式細胞儀檢測，分析兩種藥物對CD4+CD25+Treg細胞體外增殖的影響。數(shù)據(jù)運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，

5、結果以均數(shù)±標準差表示，采用配對樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 第一部分:通過密度梯度離心法結合免疫磁珠法共提取CD4+CD25+Treg細胞15例，其中1例出現(xiàn)細胞污染，6例雙陽性率低于80％，予以丟棄，其余8例CD4+CD25+Treg細胞純度達到(97±0.8)％，且細胞內Foxp3表達率達(99±0.5)％。CD4+CD25+Treg細胞體外正常分化增殖，適宜條件下培養(yǎng)7天后流式細胞儀檢測

6、原代細胞比例占(37.0±3.5)％，14天后光學顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)量可擴增至150倍左右;體外CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25-T淋巴細胞1∶1混合培養(yǎng)7天后，流式細胞儀檢測CD4+CD25-T淋巴細胞原代細胞比例占(79.4±6.9)％，經(jīng)統(tǒng)計學分析CD4+CD25+Treg細胞可明顯抑制CD4+CD25-T淋巴細胞的增殖(P＜0.05)。
　　 第二部分:雷帕霉素組中CD4+CD25+Treg細胞培養(yǎng)7天后

7、經(jīng)流式細胞儀檢測原代細胞所占比例為（8.8±3.2）％，空白對照組中原代細胞所占比例為（33.2±4.3）％，通過統(tǒng)計學分析可知雷帕霉素明顯促進了CD4+CD25+Treg細胞的體外增殖(P＜0.05);相反的，經(jīng)檢測環(huán)孢素組中，CD4+CD25+Treg細胞培養(yǎng)7天后原代細胞所占比例為（48.9±7.0）％，與空白對照組相比，環(huán)孢素明顯抑制CD4+CD25+Treg細胞的體外增殖(P＜0.05)。
　　 結論
　　 ①

8、免疫磁珠法提取得到的CD4+CD25+Treg細胞純度可達到95％以上，F(xiàn)oxp3表達率達99％以上，且具有省時高效、便于操作等眾多優(yōu)點，是進行CD4+CD25+Treg細胞相關研究的理想提取方式;
　　 ②雷帕霉素對CD4+CD25+Treg細胞的體外增殖起著明顯促進作用，而環(huán)孢素則抑制CD4+CD25+Treg細胞的增殖分化，可見從CD4+CD25+Treg細胞的角度分析，雷帕霉素一定程度上有利于移植后患者免疫耐受的形成，而