雷帕霉素對(duì)腦出血大鼠預(yù)后的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1、探索SD大鼠發(fā)生出血性腦卒中后腦內(nèi)mTOR信號(hào)通路的改變情況;
　　2、探索雷帕霉素對(duì)出血性腦卒中大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響以及其對(duì)顱內(nèi)mTOR信號(hào)的作用;
　　3、研究雷帕霉素對(duì)出血性腦卒中大鼠外周血及出血側(cè)半腦中免疫炎癥的影響。
　　方法:
　　1、采用膠原酶Ⅳ顱內(nèi)立體定向注射的方法，建立大鼠出血性腦卒中的模型，然后分別于出血后30min，1h，4h，1d，3d，7d處死大鼠，取出血側(cè)半腦，分

2、離進(jìn)針點(diǎn)前后2cm腦組織內(nèi)的皮質(zhì)和紋狀體組織，4℃下裂解離心得到蛋白上清液，免疫印跡檢測(cè)mTOR蛋白及p70S6蛋白的磷酸化情況;
　　2、用一種改良的神經(jīng)功能缺失嚴(yán)重程度評(píng)分方法(modified NeurologicalSeverity Scores mNSS)，在建模及腹腔注射雷帕霉素后1d、3d、7d、14d進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)價(jià)雷帕霉素對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能預(yù)后的影響;
　　3、在腹腔注射雷帕霉素4h后，取外周血分

3、離得到血清，取出血周圍腦組織分離得到蛋白上清液，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上訴兩種標(biāo)本中INF-γ和IL-10的水平，評(píng)價(jià)雷帕霉素對(duì)出血性腦卒中大鼠外周血及出血側(cè)半腦中早期炎癥反應(yīng)的影響。
　　4、雷帕霉素腹腔注射后3天，取外周血和出血側(cè)半腦，分離得到單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4抗體，APC標(biāo)記的抗大鼠CD25抗體，和PE標(biāo)記抗大鼠FoxP3抗體識(shí)別CD4+CD25+Foxp3+T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg細(xì)胞)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)

4、，評(píng)價(jià)雷帕霉素對(duì)出血性腦卒中大鼠外周血及出血側(cè)半腦中免疫調(diào)節(jié)的影響
　　結(jié)果:
　　1、免疫印跡結(jié)果提示，大鼠腦出血后，血腫周圍的mTOR蛋白的磷酸化水平在30分鐘內(nèi)迅速升高，并且在1小時(shí)達(dá)到高峰，在1天左右時(shí)回到未出血水平，表現(xiàn)為一種快速而短暫的升高，同時(shí)，其下游信號(hào)蛋白p70S6具有相似的磷酸化表現(xiàn)，然而皮質(zhì)部分的mTOR蛋白磷酸化水平相比未出血組無明顯變化。
　　2、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的結(jié)果提示，相比未注射雷帕霉素的

5、大鼠，不同濃度的雷帕霉素（150μ g/kg，250μg/kg和500μg/kg）腹腔注射的腦出血大鼠神經(jīng)功能在1d、3d、7d、14d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有明顯改善(P＜0.05)，但150μg/kg和250μg/kg劑量組之間不存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且500μg/kg劑量組的大鼠死亡率較高，達(dá)50％;
　　3、雷帕霉素腹注4小時(shí)后，提取血腫周圍腦組織的蛋白，行免疫印跡結(jié)果提示，不同濃度的雷帕霉素能夠明顯抑制mTOR的激活，但150μ

6、g/kg和250μg/kg劑量組之間不存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，雷帕霉素注射后4h，大鼠外周血及血腫周圍IL-10升高而INF-γ則明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　5、流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果提示，雷帕霉素注射后3d，大鼠外周血和出血側(cè)半腦Treg細(xì)胞水平相比出血組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，而出血組和未出血組之間無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、SD大鼠發(fā)

7、生出血性腦卒中后，血腫周圍mTOR信號(hào)呈現(xiàn)快速而短暫的激活，而腦皮質(zhì)內(nèi)mTOR信號(hào)在出血前后無明顯改變;
　　2、在大鼠發(fā)生出血性腦卒中的早期，腹腔注射一定劑量的雷帕霉素有助于改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺失，促進(jìn)大鼠的神經(jīng)行為恢復(fù)，并且150μg/kg濃度的雷帕霉素為其最佳劑量。
　　3、雷帕霉素可以抑制腦出血后血腫周圍mTOR信號(hào)的激活，并且降低外周血及血腫周圍促炎因子INF-γ的水平，提高抑炎因子IL-10水平和Treg細(xì)