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文檔簡介
1、目的:
干眼是眼科最常見疾病之一,而自身免疫性干眼如Sjogren's綜合征(Sjogren's syndrome,SS)相關(guān)干眼是淚液缺乏型干眼的主要原因。干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制尚未明確,研究認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)、激素、基因、病毒、神經(jīng)和環(huán)境改變等眾多因素均參與了SS的致病過程。近年研究指出,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)功能異常促進(jìn)了干燥綜合征的發(fā)生發(fā)展。本文的研究目的是建立穩(wěn)定的兔自身免疫性干眼模型,結(jié)合臨床表現(xiàn)、
2、組織病理,對淚液系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行分析,研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性干眼發(fā)病中所起作用。
方法:
1.分離提純兔淚腺上皮細(xì)胞,對分離的原代細(xì)胞進(jìn)行活性鑒定并培養(yǎng)。
2.淚腺上皮細(xì)胞獨(dú)立培養(yǎng)2天后,分離自體外周血淋巴細(xì)胞,以1∶1比例將二者混合培養(yǎng)。BrdU檢測外周血淋巴細(xì)胞的增殖比率。
3.誘導(dǎo)兔自身免疫性干眼:將激活的自體淋巴細(xì)胞經(jīng)耳緣靜脈回輸供體兔體內(nèi)。
3、回輸細(xì)胞前及回輸后2周、4周、6周、8周分別觀察兔角膜染色、淚膜破裂時間、淚液分泌等臨床體征,回輸細(xì)胞4周后處死,收集雙側(cè)上淚腺、下淚腺及結(jié)膜進(jìn)行組織病理HE染色。
4.取淚腺組織提取總RNA,real-time PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、TGF-β、IFN-γ的表達(dá)。
5.流式細(xì)胞儀檢測淚腺組織、脾臟中CD4+CD25+Treg比例變化。
6.免疫磁珠分選
4、CD4+CD25+Treg,使其與淚腺上皮細(xì)胞及外周血T淋巴細(xì)胞混合共培養(yǎng),BrdU檢測CD4+CD25+Treg對效應(yīng)T細(xì)胞是否起到抑制作用。
結(jié)果:
1.成功分離獲得純度較高的兔淚腺上皮細(xì)胞。
2.建立兔淚腺上皮細(xì)胞與自體外周血淋巴細(xì)胞的混合共培養(yǎng)體系,自體外周血淋巴細(xì)胞被淚腺上皮細(xì)胞激活,BrdU檢測增殖比率為3.71。
3.成功建立兔自身免疫性干眼模型:激活的淋巴細(xì)胞回輸回
5、體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生兔自身免疫性干眼。與正常組相比,干眼模型組淚液分泌顯著減少(P<0.05),淚膜破裂時間縮短(P<0.05),熒光素鈉染色顯示角膜彌漫點(diǎn)狀著色。靜脈注射激活的淋巴細(xì)胞4周后,淚腺和結(jié)膜組織HE染色均顯示淋巴細(xì)胞浸潤。
4.real-time PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,干眼模型組淚腺中炎性因子IL-6、IL-17、TNF-a、IFN-γ的表達(dá)呈不同程度增加,抑炎因子IL-10,TGF-β的表達(dá)明顯降低(P
6、<0.05)。
5.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在兔干眼模型中,脾臟和淚腺組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例降低。
6.CD4+CD25+Treg可以抑制淚腺特異性效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。
結(jié)論:
經(jīng)自體淚腺細(xì)胞刺激激活的外周血淋巴細(xì)胞通過耳緣靜脈回輸后可誘導(dǎo)穩(wěn)定的兔干眼模型,在兔干眼發(fā)病過程中,CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫抑制作用減弱,Th17細(xì)胞功能亢進(jìn),細(xì)胞因子TNF-a、
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