兔自身免疫性干眼調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞因子的研究.pdf

1、目的：
　　 干眼是眼科最常見疾病之一，而自身免疫性干眼如Sjogren's綜合征(Sjogren's syndrome，SS)相關(guān)干眼是淚液缺乏型干眼的主要原因。干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)、激素、基因、病毒、神經(jīng)和環(huán)境改變等眾多因素均參與了SS的致病過程。近年研究指出，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)功能異常促進(jìn)了干燥綜合征的發(fā)生發(fā)展。本文的研究目的是建立穩(wěn)定的兔自身免疫性干眼模型，結(jié)合臨床表現(xiàn)、

2、組織病理，對淚液系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行分析，研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性干眼發(fā)病中所起作用。
　　 方法：
　　 1.分離提純兔淚腺上皮細(xì)胞，對分離的原代細(xì)胞進(jìn)行活性鑒定并培養(yǎng)。
　　 2.淚腺上皮細(xì)胞獨(dú)立培養(yǎng)2天后，分離自體外周血淋巴細(xì)胞，以1∶1比例將二者混合培養(yǎng)。BrdU檢測外周血淋巴細(xì)胞的增殖比率。
　　 3.誘導(dǎo)兔自身免疫性干眼:將激活的自體淋巴細(xì)胞經(jīng)耳緣靜脈回輸供體兔體內(nèi)。

3、回輸細(xì)胞前及回輸后2周、4周、6周、8周分別觀察兔角膜染色、淚膜破裂時(shí)間、淚液分泌等臨床體征，回輸細(xì)胞4周后處死，收集雙側(cè)上淚腺、下淚腺及結(jié)膜進(jìn)行組織病理HE染色。
　　 4.取淚腺組織提取總RNA，real-time PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、TGF-β、IFN-γ的表達(dá)。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測淚腺組織、脾臟中CD4+CD25+Treg比例變化。
　　 6.免疫磁珠分選

4、CD4+CD25+Treg，使其與淚腺上皮細(xì)胞及外周血T淋巴細(xì)胞混合共培養(yǎng)，BrdU檢測CD4+CD25+Treg對效應(yīng)T細(xì)胞是否起到抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功分離獲得純度較高的兔淚腺上皮細(xì)胞。
　　 2.建立兔淚腺上皮細(xì)胞與自體外周血淋巴細(xì)胞的混合共培養(yǎng)體系，自體外周血淋巴細(xì)胞被淚腺上皮細(xì)胞激活，BrdU檢測增殖比率為3.71。
　　 3.成功建立兔自身免疫性干眼模型:激活的淋巴細(xì)胞回輸回

5、體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生兔自身免疫性干眼。與正常組相比，干眼模型組淚液分泌顯著減少(P＜0.05)，淚膜破裂時(shí)間縮短(P＜0.05)，熒光素鈉染色顯示角膜彌漫點(diǎn)狀著色。靜脈注射激活的淋巴細(xì)胞4周后，淚腺和結(jié)膜組織HE染色均顯示淋巴細(xì)胞浸潤。
　　 4.real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，干眼模型組淚腺中炎性因子IL-6、IL-17、TNF-a、IFN-γ的表達(dá)呈不同程度增加，抑炎因子IL-10，TGF-β的表達(dá)明顯降低(P

6、＜0.05)。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在兔干眼模型中，脾臟和淚腺組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例降低。
　　 6.CD4+CD25+Treg可以抑制淚腺特異性效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)自體淚腺細(xì)胞刺激激活的外周血淋巴細(xì)胞通過耳緣靜脈回輸后可誘導(dǎo)穩(wěn)定的兔干眼模型，在兔干眼發(fā)病過程中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫抑制作用減弱，Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)，細(xì)胞因子TNF-a、