補體系統(tǒng)在實驗性自身免疫性葡萄膜炎中對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　1.最近的研究結(jié)果表明，通過抑制補體系統(tǒng)的活性可以有效用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。然而，在自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）中，補體過敏毒素受體C3aR和C5aR對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚不明確。因此，本課題通過比較野生型（wildtype, WT）小鼠與補體過敏毒素受體 C3aR/C5aR雙基因敲除（double knockout，DKO）小鼠之間 EA

2、U的表現(xiàn)，以及葡萄膜炎致病性T細(xì)胞的功能來明確C3aR和C5aR在EAU病程發(fā)展中的重要性。
　　2.體內(nèi)的補體系統(tǒng)需要激活后才能發(fā)揮作用，雖然已有報道顯示旁路途徑的激活對EAU發(fā)病輕重產(chǎn)生影響，但是經(jīng)典途徑以及凝集素途徑的激活對EAU發(fā)病的作用還尚不清楚。C4是經(jīng)典途徑以及凝集素途徑中的共同成分，C1q是經(jīng)典途徑中的啟動因子。因此，本課題進(jìn)一步通過誘導(dǎo)WT與C4KO、C1qKO小鼠的EAU，明確補體激活經(jīng)典途徑與凝集素途徑對EA

3、U的影響。
　　實驗方法：
　　1.利用光感受器間維生素 A類結(jié)合蛋白（interphotoreceptor binding protein， IRBP）多肽片段651-670，分別誘導(dǎo) C57BL／6J WT小鼠和 C3aR/C5aR DKO小鼠 EAU發(fā)病模型。免疫后，通過間接眼底鏡每日觀察疾病的發(fā)展過程，記錄下臨床評分。免疫進(jìn)行兩周后，進(jìn)行眼底視網(wǎng)膜成像——包括局部內(nèi)窺鏡眼底成像（ topical endoscopic

4、 fundus imaging， TEFI），共焦激光掃描眼底鏡（ confocal scanning laser ophthalmoscopy， cSLO），光學(xué)相干斷層掃描（spectral domain optical coherence tomography，SD-OCT）以及視網(wǎng)膜功能電生理檢查。觀察結(jié)束后，取眼球石蠟包埋切片 HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)評估。主動免疫第2或3周，取脾臟分離脾細(xì)胞，在含 IRBP抗原的培養(yǎng)基中進(jìn)行體

5、外培養(yǎng)，另設(shè) EAU不相關(guān)抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA）多肽片段323-339以及無抗原組做為實驗對照，72小時后用 ELISA測定細(xì)胞上清液中 Th1， Th17相關(guān)細(xì)胞因子 IFN-γ，IL-17。在過繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo) EAU發(fā)病的實驗中，分別主動免疫WT與DKO小鼠，第14天分離出脾臟中的T細(xì)胞，體外IRBP刺激培養(yǎng)擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞，過繼轉(zhuǎn)移至na?ve WT小鼠誘導(dǎo)眼部炎癥。
　　2.除此之外,利用IRBP651

6、-670分別誘導(dǎo)WT與C4KO，C1qKO小鼠EAU模型。除上述的臨床觀察，視網(wǎng)膜成像，組織病理學(xué)評估，T細(xì)胞召回實驗以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ，IL-17檢測以外，還利用IRBP651-670特異性MHC-I/多肽四聚體復(fù)合物(Tetramer復(fù)合物)進(jìn)行抗原特異性CD4陽性T細(xì)胞檢測。為比較WT與C4KO小鼠抗原提呈細(xì)胞的功能，體外分別培養(yǎng)小鼠骨髓來源樹突細(xì)胞（bone marrow derived dendritic cells

7、，BMDCs），誘導(dǎo)成熟后與轉(zhuǎn)基因OTII小鼠的脾臟T細(xì)胞在含有OVA多肽片段323-339的條件下共培養(yǎng)，72小時后利用CFSE標(biāo)記檢測脾臟細(xì)胞的增殖。為檢測WT與C4KO小鼠脾臟中致病性T細(xì)胞的活性，磁珠分選小鼠脾臟細(xì)胞中CD4陽性的T細(xì)胞，在Th0及Th1分化條件的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，并在不同的時間點分別使用 CD25，CD69抗體檢測T細(xì)胞激活標(biāo)記物；Brdu和CFSE標(biāo)記分析T細(xì)胞增殖；Annexin V和PI染色分析T細(xì)胞凋亡

8、；IFN-γ抗體檢測T細(xì)胞分化。
　　實驗結(jié)果：
　　1. EAU誘導(dǎo)后，臨床評分，視網(wǎng)膜成像，組織病理學(xué)評分的結(jié)果一致，均顯示出DKO比WT小鼠表現(xiàn)出較輕的炎癥。電生理檢測顯示DKO EAU小鼠的視網(wǎng)膜功能明顯優(yōu)于 WT EAU小鼠。T細(xì)胞體外召回實驗結(jié)果表明，DKO EAU小鼠脾臟細(xì)胞對 IRBP的免疫應(yīng)答低于 WT對照組，表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ與IL-17的水平明顯減低。另外，T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)EAU的實驗表

9、明,來自WT EAU小鼠脾臟中的IRBP特異性T細(xì)胞，其致病能力明顯強于DKO EAU小鼠的T細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)na?ve小鼠表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的葡萄膜炎。
　　2. C4KO比WT小鼠EAU的發(fā)病明顯減輕，但C1qKO與WT小鼠的炎癥表現(xiàn)無顯著差異。視網(wǎng)膜成像、組織病理學(xué)評分，以及 T細(xì)胞體外召回實驗的結(jié)果與臨床觀察結(jié)果相一致。此外，Tetramer染色結(jié)果表明C4KO EAU小鼠脾臟細(xì)胞中IRBP特異性T細(xì)胞比例明顯低于WT對照組。<

10、br>　　3. C4KO小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞抗原提呈能力與WT小鼠并無明顯區(qū)別，但是其脾臟中 CD4陽性 T細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下活化，增殖，分化能力均不及WT小鼠 CD4陽性 T細(xì)胞，同時比來自 WT的 CD4陽性T細(xì)胞更易誘導(dǎo)凋亡。
　　實驗結(jié)論：
　　1.補體過敏毒素C3a和C5a及其受體C3aR和C5aR，在EAU的病程中發(fā)揮重要作用。
　　2.補體激活經(jīng)典途徑與凝集素途徑共同成分C4對EAU的發(fā)展有顯著影響，