間充質干細胞治療大鼠自身免疫性葡萄膜炎作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，可用于多種自身免疫性疾病的治療。葡萄膜炎是眼科常見的自身免疫性疾病，本研究通過建立實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)動物模型，觀察MSCs對EAU的治療作用，檢測MSCs對EAU病程中各免疫細胞群細胞因子及IL-27表達的動態(tài)影響，初步探討MSCs治療EAU的機制

2、。
　　方法：
　　1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓MSCs，流式細胞術對MSCs進行表型鑒定。
　　2.雄性Lewis大鼠75只隨機分為正常組、對照組、0天、12天干細胞治療組。皮下注射完全弗氏佐劑乳化的光感受器維生素A類結合蛋白(interphotoreceptorbinding protein，IRBP)R16肽段免疫建立EAU動物模型，分別在免疫后當天及12天尾靜脈輸注MSCs，連續(xù)3天。對照組輸注等體

3、積的磷酸鹽緩沖液。
　　3.自免疫后第4天裂隙燈下觀察各組大鼠眼部表現(xiàn)，參照Caspi標準進行評分。
　　4.分別在免疫后第6、9、12、15、20天處死大鼠，摘除眼球，HE染色后進行病理組織學觀察，參照Caspi標準進行評分。
　　5.分別在免疫后第6、9、12、15、20天處死大鼠，分離脾臟淋巴結單個核細胞，體外培養(yǎng)72小時后ELISA檢測Th1/Th2/Th17/Treg細胞因子及IL-27表達量，分析其動態(tài)變化

4、趨勢。
　　6.取各組大鼠脾臟淋巴結單個核細胞，流式細胞術測定各時間點Th17及Treg占CD4+細胞的比例，分析其動態(tài)變化趨勢。
　　7.取免疫后第12天EAU大鼠脾臟淋巴結單個核細胞，與MSCs共同接種并體外培養(yǎng)72小時，ELISA檢測Th1/Th2/Th17/Treg相關細胞因子及IL-27表達量。
　　8.取免疫后第6、9、12、15、20天各組大鼠房水，ELISA檢測IFN-γ、IL-10及IL-27的表達量

5、，分析其動態(tài)變化趨勢。
　　結果：
　　1.成功分離培養(yǎng)并鑒定MSCs。
　　2.成功建立了EAU動物模型。
　　3.對照組大鼠免疫后第6天開始出現(xiàn)EAU癥狀，第12天達高峰，其后逐漸減輕，MSCs治療組EAU癥狀明顯減輕，較對照組炎癥評分顯著降低(P<0.05)。
　　4.免疫后第6天對照組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤，12天達高峰，視網(wǎng)膜組織結構紊亂破壞，其后細胞浸潤減輕。MSCs治療組組織學評分較對

6、照組顯著降低(P<0.05)。
　　5.脾臟淋巴結單個核細胞細胞因子ELISA測定結果：對照組Th1、Th17型細胞因子表達量與EAU病情變化趨勢相同，與組織病理學評分呈正相關，MSCs治療組表達量在各時間點較對照組顯著減低(P<0.05)。Th2、Treg型細胞因子及IL-27表達量與EAU病情變化趨勢相反，與組織病理學評分呈負相關，MSCs治療組表達量較對照組顯著增加(P<0.05)。
　　6.Th17、Treg流式細胞

7、術結果：對照組Th17群百分比與EAU病情變化趨勢相同，與組織病理學評分呈正相關，MSCs治療組Th17百分比較對照組顯著降低(P<0.05)。對照組Treg群百分比與EAU病情變化趨勢相反，與EAU組織病理學評分呈負相關，MSCs治療組Treg百分比較對照組顯著增高(P<0.05)。
　　7.共培養(yǎng)顯著降低了IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-17的表達量，增加了TGF-β、IL-4、IL-10及IL-27的表達量(P<0.0

8、5)。
　　8.房水細胞因子ELISA結果：對照組房水IFN-γ表達量與EAU病情變化趨勢相同，與組織病理學評分呈正相關，MSCs治療組IFN-γ表達量顯著降低(P<0.05)。對照組房水IL-10表達量與EAU病情變化趨勢相反，與組織病理學評分呈負相關，MSCs治療組房水IL-10、IL-27表達量顯著增高(P<0.05)。
　　結論：
　　1.Th1、Th2、Th17及Treg均參與了EAU的發(fā)生發(fā)展，Th1、Th

9、17是EAU的主要效應細胞群。Th2、Treg對EAU具有保護作用。
　　2.MSCs治療顯著抑制了EAU的發(fā)生發(fā)展。
　　3.MSCs通過抑制IL-2、IL-6等促Th1、Th17分化因子的表達，減少了EAU病程中Th1、Th17細胞群的數(shù)量及其效應細胞因子IFN-γ、IL-17的表達；通過增加IL-4、TGF-β等促Th2、Treg分化因子的表達，增加了EAU病程中Th2、Treg細胞群數(shù)量及其相關細胞因子IL-10的表