間充質(zhì)干細(xì)胞移植對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)是常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病(autoimmunedisease，AID)，患者表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘及相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動障礙。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimentalautoimmuneencephalomyelintis，EAE)是自身免疫性MS的模型，也被稱為實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓膜炎(experimentalallergicenceph

2、alomyelintis，EAE)，其臨床表現(xiàn)、病理特征和免疫異常等均與人類MS極其類似，故EAE常被用于研究MS病理進(jìn)展機(jī)制和觀察判斷MS治療方案的有效性。大量MS免疫病理研究證實(shí)髓磷脂蛋白抗原被CD4+T細(xì)胞識別，誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答。免疫細(xì)胞被異?；罨⑦w移進(jìn)入CNS，在CNS與表達(dá)自身髓磷脂蛋白抗原的細(xì)胞相互作用，通過一系列炎癥因子最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病變與效應(yīng)性T細(xì)胞過度活化、炎癥細(xì)胞在CNS浸潤、

3、前炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的產(chǎn)生高度相關(guān)。Th1和Th17產(chǎn)生的細(xì)胞因子如干擾素-γ(interferon，IFN-γ）、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(interleukin2，IL-2)和IL-17能加速疾病進(jìn)展，甚至IFN-γ能誘導(dǎo)脫髓鞘和神經(jīng)元損傷。Th2細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells，Treg)能抑制自身免疫反應(yīng)，通過產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10、

4、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）、IL-4限制疾病進(jìn)展。有研究表明EAE小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量和免疫抑制功能均降低，給EAE小鼠輸入功能性Treg細(xì)胞能改善其病理狀況。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcell，MSC)是骨髓中除造血干細(xì)胞外的成體干細(xì)胞，廣泛存在于骨髓和肝臟等多種組織。MSCs具有多潛能、自我更新和潛在的多向分化能力。MSCs能分化成各種中胚層

5、起源的組織，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。MSCs很容易獲得，具有強(qiáng)大的潛在體外擴(kuò)增能力，且免疫原性弱，因此MSC作為組織再生的種子細(xì)胞具有良好的臨床應(yīng)用前景。MSCs也被發(fā)現(xiàn)具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，能抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖，能誘導(dǎo)產(chǎn)生Tregs，也能抑制抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)成熟及其功能。上述各種研究報道表明，MSCs在治療自身免疫病方面有潛在的應(yīng)用前景，但有關(guān)機(jī)制仍不十分清楚

6、，本研究旨在通過探討MSCs移植對EAE小鼠體內(nèi)免疫器官中Treg數(shù)量、Foxp3、IL-10、TGF-β的影響，揭示MSCs對人類自身免疫病MS治療的機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動物:選擇6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠用于EAE模型制作;選擇雄性C57BL/6J小鼠做為同基因MSCs移植細(xì)胞來源，選擇雄性Balb/c小鼠做為異基因MSCs移植細(xì)胞來源。
　　2、免疫原的制備:選擇髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(

7、myelinoligodendrogliaglycoprotein，MOG)的MOG35-55多肽（氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）做抗原，等體積與完全弗氏佐劑(completeFreundadjuvant，CFA)充分混勻制成油包水樣乳劑，即為免疫原。
　　3、EAE模型的制作和神經(jīng)功能評分:通過給C57BL/6J小鼠多點(diǎn)多次注射免疫原，誘導(dǎo)小鼠成為EAE模型。每日觀察小鼠運(yùn)動、飲食等，記錄小鼠癥狀、體征

8、、體重變化，參照Kono等的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。免疫原致敏14-20d，凡評分≥1分者可作為EAE模型。
　　4、小鼠MSCs的分離和培養(yǎng):用PBS沖洗C57BL/6J和BALB/c小鼠脛、腓骨，獲得骨髓細(xì)胞，溶解紅細(xì)胞后，將106/ml骨髓細(xì)胞置MSC培養(yǎng)液5％CO237℃孵育。72h去除非粘附細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞融合至80％～90％培養(yǎng)瓶壁時，用胰蛋白酶消化，洗滌后加入MSC培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)至10～15d。給每只實(shí)驗(yàn)鼠尾靜

9、脈注射細(xì)胞總數(shù)為106MSCs。
　　MSC擴(kuò)增培養(yǎng)液:高糖DMEM(DulbeccomodifiedEaglesmedium，Gibco產(chǎn)品)，熱滅活10％胎牛血清，50μg/mLgentamycin，2mML-glutamine，100μMnon-essentialaminoacids,10mMHEPES,55μM2-Mecaptoethanol。
　　5、MSCs移植:將40只C57BL/6J小鼠分為4組，每組10只。

10、A、B、C組為EAE誘導(dǎo)組，符合EAE神經(jīng)功能評分條件。在EAE誘導(dǎo)后第20～22d，A組小鼠經(jīng)尾靜脈注射106（200μL）BALB/c小鼠MSCs（異基因MSCs移植組），B組EAE小鼠經(jīng)尾靜脈注射106（200μL）C57BL/6J小鼠MSCs（同基因MSCs移植組），C組EAE小鼠經(jīng)尾靜脈注射200μLPBS（為EAE對照組），D組小鼠為非EAE誘導(dǎo)的正常小鼠（正常對照組）。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)分析:在MSCs移植40d，

11、處死小鼠，分別無菌獲取胸腺、脾臟、淋巴結(jié)，通過機(jī)械研磨、裂解紅細(xì)胞后制成單個核細(xì)胞懸液，利用反復(fù)離心法將細(xì)胞用含1％BSA和0.1％sodiumazide的PBS洗3次，加入FITC-抗小鼠CD4mAb（0.125μg/106細(xì)胞）、APC-抗小鼠CD25mAb（0.06μg/106細(xì)胞，eBioscience產(chǎn)品)，檢測細(xì)胞膜表面CD4、CD25分子的表達(dá)，以同型抗體做對照，冰上避光孵育30min。對于細(xì)胞內(nèi)存在的Foxp3檢測，需要

12、首先將細(xì)胞固定、破膜處理（用Foxp3stainingbuffer，eBioscience產(chǎn)品），再用PE-抗小鼠Foxp3mAbs(0.5μg/106細(xì)胞，eBioscience)染色。染色后細(xì)胞用流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD)檢測。
　　7、Realtime(RT)-PCR法檢測Foxp3、TGF-TGF-β1、IL-10mRNA表達(dá):分別從MSCs移植后20d、40d、60d各組小鼠中摘取胸腺、脾臟和淋巴結(jié)，制成單

13、細(xì)胞懸液，分別于107個胸腺細(xì)胞、脾臟細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞中加入Trizol試劑（Invitrogen產(chǎn)品）提取總RNA，用RTKit（Takara產(chǎn)品）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBRgreenIrealtimePCRKit(Takara)試劑盒進(jìn)行Foxp3、TGF-TGF-β1和IL-10mRNA檢測。
　　8、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制作用:采用CD4+CD25+細(xì)胞分選試劑和免疫磁珠法

14、分選出正常小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞，經(jīng)CD3單抗和CD28單抗活化在含IL-2的培養(yǎng)基中，與CD4+CD25+T細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT法檢測細(xì)胞增殖。即:將正常對照組小鼠的CD4+CD25-細(xì)胞100μL加入到各包被孔中，每孔分別正常對照組、EAE組、異基因MSCs移植組、同基因MSCs移植組的CD4+CD25+T細(xì)胞100μL，設(shè)3個復(fù)孔，置5％CO2飽和濕度37℃培養(yǎng)24h。每孔加入MTT(5mg/mL)20)μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小

15、心吸去培養(yǎng)孔中上清，每孔加入二甲亞砜100μL，反復(fù)吹打使細(xì)胞裂解，用酶標(biāo)分析儀570nm記錄各孔吸光度值（A值）。
　　9、統(tǒng)計學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果p＜0.05為有限制性差異。
　　結(jié)果：
　　1、MSCs體外培養(yǎng)、增殖特征:初分離的骨髓單個核細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)為小球形，誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4d后部分細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶壁，形狀似紡錘形，有較強(qiáng)折光性。培養(yǎng)至7～10

16、d，絕大多數(shù)細(xì)胞貼附于瓶壁，并逐漸生長形成分散的或條索狀聚集狀態(tài)，細(xì)胞體積顯著增大。細(xì)胞被繼續(xù)傳代培養(yǎng)，將反復(fù)傳3～4代的MSCs用于細(xì)胞移植。
　　2、MSCs移植改善EAE小鼠臨床評分
　　每日觀察和記錄各組小鼠EAE一般情況和神經(jīng)功能評分，結(jié)果顯示:EAE誘導(dǎo)14d，EAE組小鼠出現(xiàn)顯著異常表現(xiàn)，85％EAE誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能評分增加，達(dá)到2分以上，部分小鼠出現(xiàn)尾部癱瘓、弓背，部分小鼠表現(xiàn)為后肢無力、甚至癱瘓，也有部

17、分小鼠在5d內(nèi)直接發(fā)展到前肢無力。異基因MSCs移植組和同基因MSCs移植組，神經(jīng)功能評分顯著降低，并隨時間延長，神經(jīng)功能評分降低更加明顯，在一周內(nèi)神經(jīng)功能評分迅速達(dá)到最低值，MSCs移植后神經(jīng)功能持續(xù)改善，維持20d以上。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示:異基因MSCs移植組與EAE對照組相比有顯著差異，p＜0.01;同基因MSCs移植組與EAE對照組相比有顯著差異，p＜0.01;異基因MSCs移植組與同基因MSCs移植組相比，無顯著差異，p＞0.0

18、5。
　　3、MSCs移植影響EAE小鼠脾臟、淋巴結(jié)、胸腺CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量
　　在MSCs移植20d，無菌獲取胸腺、脾臟、腸系膜和腋窩淋巴結(jié)，制備單細(xì)胞懸液，用熒光標(biāo)記抗體和流式細(xì)胞術(shù)分析胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示:脾臟中的CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞，EAE組顯著低于正常對照組(p=0.032)、異基因MSCs移植組(p＜0.01)和同基因MS

19、Cs移植組(p=0.018)。淋巴結(jié)中的CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例，EAE組也顯著低于正常對照組、異基因MSCs移植組及同基因MSCs移植組，p值均＜0.01。胸腺中的CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例，EAE組低于正常對照組(p=0.025、異基因MSCs移植組(p＜0.01)及同基因MSCs移植組(p=0.036)。
　　4、MSCs移植改變EAE小鼠胸腺、脾臟Foxp3，TGF-β1andIL-10mRN

20、A水平
　　分別在MSCs移植20d、40d、60d處死小鼠，摘取胸腺、脾臟、淋巴結(jié)，制備單個核細(xì)胞，從107個細(xì)胞中提取總RNA，通過RT-PCR法檢測Foxp3、TGF-β1和IL-10的表達(dá)。結(jié)果顯示:Foxp3、TGF-β1和IL-10mRNA在正常對照組胸腺、脾臟和淋巴結(jié)穩(wěn)定表達(dá)，EAE組小鼠Foxp3mRNA低表達(dá)，并逐漸下降至60d時間點(diǎn)達(dá)到最低。EAE組和正常對照組相比，上述各指標(biāo)均有顯著差異，p＜0.01。

21、>　　在異基因MSCs移植20d，小鼠脾臟、淋巴結(jié)和胸腺Foxp3mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，隨后逐漸增高正常水平，在異基因MSCs移植60d，與EAE組相比各器官Foxp3mRNA表達(dá)均有顯著差異，p＜0.01。
　　在同基因MSCs移植組，脾臟、淋巴結(jié)、胸腺Foxp3mRNA的表達(dá)結(jié)果與異基因MSCs移植組相似，與EAE組相比各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異，p＜0.01。
　　脾臟、淋巴結(jié)、胸腺TGF-β1mRNA在EAE組、MSCs異基

22、因移植組和同基因移植組均表現(xiàn)為低表達(dá)（MSCs移植20d時），EAE組TGF-β1mRNA持續(xù)降低，并在60d時達(dá)到最低點(diǎn)，與正常對照組相比有顯著差異，p＜0.01。異基因移植組和同基因移植組隨時間延長TGF-β1mRNA水平逐漸增加至正常水平，與EAE組相比有顯著差異，p＜0.01。
　　IL-10mRNA在脾臟、淋巴結(jié)和胸腺中的表達(dá)水平有相似的趨勢，異基因移植組、同基因移植組與EAE組相比，均有顯著差異，p＜0.01。

23、　　5、CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)對CD4+CD25-T細(xì)胞(Teff)增殖的抑制作用
　　EAE組小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞對CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制作用顯著降低，與正常對照組相比，P＜0.01;同基因MSCs移植組與異基因MSCs移植組CD4+CD25+T細(xì)胞對CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞增殖作用顯著增強(qiáng)，與EAE組相比有顯著差異，P＜0.01;同基因MSCs移植組與異基因MSCs移植組相比，無顯著差

24、異，P＞0.05。
　　結(jié)論：
　　本研究利用MOG多肽注射小鼠成功誘導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)小鼠模型，并通過注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)使EAE小鼠神經(jīng)功能評分降低，使胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率增加和Foxp3、TGF-β1和IL-10mRNA表達(dá)水平增加。說明MSCs移植能預(yù)防EAE進(jìn)展，并可成為臨床治療MS的手段，其中MSCs移植所致CD4+CD25+Foxp3+