CD226抗體治療小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的研究.pdf

1、人CD226曾先后被稱為T細(xì)胞譜系特異性活化抗原1（TLiSA1，1985)、血小板T細(xì)胞活化抗原1（PTA1,1989）DNAX輔助分子1（DNAM-1,1996），并于2000年首次以我國實(shí)驗(yàn)室為主要研究單位在國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組（HLDA）大會(huì)上獲得編號(hào)為CD226。該分子于1996年基因克隆成功，cDNA全長(zhǎng)2603bp，包含7個(gè)外顯子，開放讀框編碼336個(gè)氨基酸，胞漿區(qū)具有磷酸化及與信號(hào)分子相互作用的位點(diǎn)。CD226分

2、子與表達(dá)于殺傷性T細(xì)胞（CTL）和NK細(xì)胞的CD96（Tactile）分子在蛋白水平有22％的同源性，與BGP-1、CD36、PRR和果蠅神經(jīng)膠質(zhì)蛋白Neuroglian也有一定的同源性。CD226成熟蛋白由318個(gè)氨基酸組成，分子量約為65kDa，屬免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，表達(dá)于T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核/血小板譜系及活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞；廣泛參與了免疫系統(tǒng)的生理和病理學(xué)功能，如T細(xì)胞、巨核細(xì)胞的分化，NK細(xì)胞

3、對(duì)腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞的殺傷，血小板的活化與聚集，單核/巨噬細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞等過程，并參與其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　CD226分子體內(nèi)天然配體于2003年得到鑒定，為同屬于nectin/Necl家族的黏附分子：人脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR/Necl-5/CD155）及其家族成員人PVR受體相關(guān)分子(PRR-2/nectin-2/CD112)，CD112同時(shí)也是單純皰疹病毒（HSV-1和HSV-2）的受體。
　　小鼠PTA1

4、/CD226基因于2002年成功克隆，由7個(gè)外顯子組成，編碼完整小鼠CD226分子的cDNA開放讀框有1002bp，編碼333個(gè)氨基酸殘基，小鼠CD226分子亦屬免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白。小鼠CD226與人CD226在核苷酸水平有67％的同源性，而在氨基酸水平有53％的同源性。已證實(shí)mCD112和mCD155（Tage4）是mCD226的配體。小鼠CD226介導(dǎo)了抗原特異性CD8+T細(xì)胞共刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可參與腫瘤的免疫監(jiān)視，而

5、小鼠CD226分子在自身免疫調(diào)節(jié)中的作用尚未有較多的研究結(jié)果。
　　Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞均可誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答，但其二者的相互關(guān)系尚未清楚。EAE最初被認(rèn)為是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的，但近期的越來越多的研究認(rèn)為，部分器官特異性自身免疫性動(dòng)物模型中，Th17細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)整個(gè)免疫病理中是必不可少的，并提出EAE首先是由Th17細(xì)胞啟動(dòng)介導(dǎo)的理論。本實(shí)驗(yàn)就小鼠CD226分子在體外培養(yǎng)體系及體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)所參與的自身免疫調(diào)節(jié)進(jìn)行了初步研究。

6、r>　　本研究中首先克隆化建立穩(wěn)定表達(dá)mPTA1-Fc融合蛋白的CHO-mPTA1/Ig細(xì)胞株，通過培養(yǎng)上清制備mPTA1-Fc融合蛋白，并成功免疫新西蘭大白兔動(dòng)物，獲得了較高的免疫血清，通過親和層析的方法純化出特異性的多抗，ELISA、SDS-PAGE電泳結(jié)果及免疫熒光流式檢測(cè)顯示，該多克隆抗體具有良好的生物學(xué)活性和較高的純度。在單抗制備過程中，將融合蛋白免疫大鼠，利用雜交瘤技術(shù)，建立制備大鼠源性單抗的平臺(tái)，從5400個(gè)克隆孔中，通過

7、交叉篩選挑選出5株陽性克隆，利用裸鼠體內(nèi)誘生腹水及無血清培養(yǎng)上清純化獲得了具有較高活性的單抗克隆抗體。所獲得的5株單抗經(jīng)ELISA、SDS-PAGE電泳結(jié)果及免疫熒光流式檢測(cè)顯示，有4株能很好的識(shí)別小鼠CD226的重組蛋白及天然分子，為后續(xù)研究mPTA1分子的表達(dá)、分布及功能提供了有利的研究工具。
　　我們利用所制備的抗體通過免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)小鼠PTA1在不同細(xì)胞系的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在小鼠肥大細(xì)胞系、小鼠單核/巨噬細(xì)胞系P

8、TA1分子表達(dá)較高。此外mPTA1分子在小鼠樹突狀細(xì)胞系表達(dá)較高，在B細(xì)胞也有組成性的表達(dá)。而在上皮細(xì)胞來源、纖維母細(xì)胞或低分化細(xì)胞來源細(xì)胞系上表達(dá)為陰性。
　　本研究還發(fā)現(xiàn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞即有mPTA1分子的高表達(dá)，CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞均表達(dá)mPTA1分子，但CD8+T細(xì)胞表達(dá)更高，小鼠NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面也有mPTA1分子的表達(dá)。小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)MLC培養(yǎng)7天后，其mPTA1的表達(dá)更加明顯，CD8+mPTA1+細(xì)

9、胞與CD4+mPTA1+細(xì)胞均有明顯增多，而且以CD8+mPTA1+細(xì)胞更為顯著。
　　同時(shí)發(fā)現(xiàn)，作為小鼠PBMC的脾淋巴細(xì)胞在經(jīng)MLC刺激的同時(shí)，與PTA1抗體共培養(yǎng)后，其細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1樣細(xì)胞因子INF-γ水平明顯升高，胞內(nèi)細(xì)胞因子的熒光標(biāo)記染色結(jié)果也有類似變化。提示PTA1分子可能在CD4+Th細(xì)胞分化中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　為進(jìn)一步研究小鼠PTA1分子所參與的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制作用，我們又進(jìn)行了mPTA1的體

10、內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)。首先我們成功建立了自身免疫性疾病的經(jīng)典動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）。用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）35-55肽段并輔以結(jié)核桿菌及百日咳毒素免疫EAE敏感動(dòng)物品系C57BL/6小鼠后，于免疫免疫后第10天開始陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)EAE的典型臨床神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，病程為慢性單時(shí)相進(jìn)展型，約在第20天達(dá)到發(fā)病高峰，發(fā)病率達(dá)到70％，同時(shí)伴隨腦組織的病理改變，HE染色檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦白質(zhì)區(qū)小血管周圍有淋巴細(xì)胞浸潤，即呈“袖

11、套樣”炎性結(jié)構(gòu)改變。LFB染色發(fā)現(xiàn)在腦的冠狀切片及脊髓縱向矢狀切片中發(fā)現(xiàn)，白質(zhì)區(qū)有LFB未著色區(qū)，髓鞘稀疏不連續(xù)，部分呈片狀脫失。EAE模型小鼠的脾淋巴細(xì)胞IFN-γ的胞內(nèi)染色水平表達(dá)較正常小鼠有明顯下降，而IL-17水平增高了近70％。
　　當(dāng)小鼠EAE模型中注射mPTA1抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)EAE的發(fā)病率、發(fā)病時(shí)間及發(fā)病程度均有較好的緩解，發(fā)病率由60％減少到30％，發(fā)病起始時(shí)間由免疫后的第7天延緩至第14天，平均臨床分?jǐn)?shù)由2.2分降