CD226分子與腫瘤和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎關(guān)系的研究.pdf

1、免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成員CD226分子是一種廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，在2000年第七屆國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組大會(huì)上獲得新的CD命名。此前，該分子被稱為“T細(xì)胞譜系特異性活化抗原1（T lineage-specific activation antigen1，TLiSA1）”、“血小板與T細(xì)胞活化抗原1（platelet and T cell act

2、ivation antigen 1，PTA1）”和“DNAX輔助分子1（DNAX accessory molecule-1，DNAM-1）”。
　　人CD226基因于1996年克隆成功，位于染色體18q22.3，其cDNA全長(zhǎng)2664bp，開(kāi)放讀框編碼336個(gè)氨基酸，其基因存在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。小鼠CD226基因由我室于2002年成功克隆，位于染色體18E4，除

3、了cDNA全長(zhǎng)為2487bp的原型分子以外，還存在三種異型。完整的CD226分子由胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成，分子量為65～67kDa，胞膜外區(qū)有2個(gè)IgSFV樣結(jié)構(gòu)域和潛在的糖基化位點(diǎn)，胞漿區(qū)有磷酸化及與信號(hào)分子相互作用的位點(diǎn)。不同種屬的CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平均高度同源，蛋白結(jié)構(gòu)也十分相似，是一個(gè)在進(jìn)化上是一個(gè)相對(duì)保守的分子，提示該分子在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程和其他生物學(xué)功能中可能扮演了極為重要的角色。此外，CD226分子

4、與CD96以及其他Nectin和Nectin樣分子（Nectin-like molecule，Necl）有較高的同源性。
　　CD226廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨核/血小板譜系、單核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、某些B細(xì)胞亞群、部分造血干細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，在免疫系統(tǒng)以外則分布于海馬和小腦皮質(zhì)的神經(jīng)突觸部位。2003年，人CD226的兩種配體鑒定成功，分別是CD112/Nectin-2和CD155/

5、Necl-5/PVR（脊髓灰質(zhì)炎病毒受體）。CD226與其配體的相互作用參與CTL和NK細(xì)胞的活化、分化和細(xì)胞毒作用，調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的增殖和分化，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與其他細(xì)胞的黏附，促進(jìn)血小板的活化與聚集，參與造血調(diào)控，介導(dǎo)肥大細(xì)胞的脫顆粒作用，參與NKT細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的抗凋亡作用、樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、免疫突觸和神經(jīng)突觸的形成，并與腫瘤、自身免疫性疾病、移植排斥及病毒感染等疾病密切相關(guān)。
　　人CD226除以膜型（mCD226）的形式

6、表達(dá)在細(xì)胞膜表面外，還以可溶型（sCD226）的形式存在于血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中。前期小規(guī)模臨床標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤和多種自身免疫性疾病患者的血清中，sCD226的水平均顯著高于正常人，但是目前關(guān)于CD226與臨床疾病的研究?jī)H限于膜型和/或可溶型CD226的表達(dá)及其基因SNP與疾病的關(guān)系，而CD226在腫瘤及自身免疫性疾病中的作用和可能的分子機(jī)制尚不清楚。
　　本研究首先制備和鑒定了一批抗人IgGFc段、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glu

7、tathione-S-transferase，GST）、麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein，MBP）和硫氧化還原蛋白（thioredoxin，Trx）等常用標(biāo)簽蛋白（tag）的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb），在此基礎(chǔ)上建立或改良了定量檢測(cè)GST、Fc、MBP和Trx或其融合蛋白的雙抗體夾心ELISA試劑盒，敏感性分別達(dá)到了1.2、15.6、1和0.4ng/ml。應(yīng)用FcELISA

8、試劑盒檢測(cè)上清中hCD226-Fc水平的方法，克隆化了高水平分泌該融合蛋白的CHO-hCD226-Fc細(xì)胞株，大量制備細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用抗FcmAb標(biāo)記的Sepharose4B親和層析柱純化了hCD226-Fc融合蛋白，用SDS-PAGE、Westernblot和流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）鑒定其純度和生物學(xué)活性，以此作為人sCD226ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品以及體外殺傷實(shí)驗(yàn)中模擬天然sCD226作用的試劑。另外，

9、還對(duì)我室前期研制的定量檢測(cè)人sCD226的雙抗體夾心ELISA試劑盒進(jìn)行了改良。
　　應(yīng)用條件優(yōu)化后的ELISA試劑盒檢測(cè)了259例腫瘤患者（包括消化、呼吸、血液、婦科、骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)等多種來(lái)源的腫瘤）及129例正常人血清中sCD226的水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中sCD226的水平（0.2-60ng/ml，中位數(shù)11.5ng/ml）明顯高于正常人（0.1-23ng/ml，中位數(shù)6.3ng/ml，P<0.001）；而在用FCM檢測(cè)外周

10、血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）上mCD226的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者PBMC上mCD226的表達(dá)（14例，1.1％-56.1％，中位數(shù)17.45％）明顯低于正常人（12例，43.1％-77.8％，中位數(shù)65.3％，P<0.001）。在體外NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的模型中用重組表達(dá)的可溶型hCD226-Fc融合蛋白模擬天然sCD226的作用，發(fā)現(xiàn)hCD226-Fc能顯著抑制NK細(xì)胞對(duì)其

11、靶細(xì)胞K562細(xì)胞的殺傷，濃度為1μg/ml時(shí)抑制率即可達(dá)到34％，而且這種抑制作用呈劑量依賴性。在佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）活化的正常人PBMC和Jurkat細(xì)胞上，3種蛋白酶抑制劑（金屬蛋白酶抑制劑1-10-phenanathroline、絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF和半胱氨酸蛋白酶抑制劑NEM）可以在上調(diào)mCD226的表達(dá)的同時(shí)下調(diào)培養(yǎng)上清中sCD226的水平，由于多種蛋白酶在

12、許多腫瘤中含量可能有所增加，提示蛋白酶解作用可能是腫瘤患者血清中sCD226的形成機(jī)制。用免疫沉淀和Western blot的方法鑒定了血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中sCD226的分子量，發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者和正常人血清以及PMA刺激的PBMC和Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)上清中，均存在～50kDa的特異性條帶，這與CD226分子的胞膜外區(qū)分子量相符。另外，血清樣本中還存在一個(gè)～45kDa的條帶，這一條帶在PMA刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中不存在，提示不同蛋白酶對(duì)CD

13、226的酶解作用可能發(fā)生在該分子胞膜外區(qū)的不同位置。
　　在搞清了腫瘤患者sCD226的表達(dá)、作用和來(lái)源的基礎(chǔ)上，我們提出了如下假說(shuō)：腫瘤患者中升高的蛋白酶可能通過(guò)酶解作用導(dǎo)致了PBMC上mCD226表達(dá)下調(diào)而血清中sCD226的水平上調(diào)，高水平的sCD226與其膜型配體CD112/CD155分子相結(jié)合，減弱了殺傷細(xì)胞上mCD226分子與腫瘤細(xì)胞表面膜型CD112/CD155的結(jié)合，從而抑制了殺傷細(xì)胞活化信號(hào)的產(chǎn)生，并最終導(dǎo)致腫瘤

14、細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。
　　本研究還用ELISA和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的方法觀察了抗人CD226的mAbLeoA1對(duì)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（mixed lymphocyte culture，MLC）和PBMC中細(xì)胞因子分泌格局及細(xì)胞亞群百分比的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)被上調(diào)的有IL-10、GM-CSF和G-CSF等，被下調(diào)的有IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-15、IL-23和TGF-α等，相關(guān)的細(xì)胞亞群包括Th1、Th2、CTL、N

15、K以及單核/巨噬和DC。采用信號(hào)分子阻斷劑的手段，分析了CD226調(diào)控MLC細(xì)胞因子分泌格局的信號(hào)通路中可能涉及的信號(hào)分子主要有p38、JNK和PI3K。
　　最后，成功建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型，證實(shí)了抗CD226抗體對(duì)EAE的發(fā)生有明顯的防治作用，其分子機(jī)制涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部炎細(xì)胞浸潤(rùn)的減輕，脾臟CD25陽(yáng)性的活化細(xì)胞數(shù)