實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠線粒體途徑凋亡模式及姜黃素保護作用探討.pdf

1、背景:
　　多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralneverous system，CNS)自身免疫性疾病，特征性病理改變包括白質(zhì)脫髓鞘、炎性細胞浸潤、軸突破壞等。MS損傷性病灶形成的病理基礎(chǔ)目前尚不十分清楚，一般認為是由T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起的的脫髓鞘事件。但最近通過MS病人尸檢標(biāo)本的研究卻發(fā)現(xiàn)MS在新病灶形成時的最初病理改變與傳統(tǒng)認識上經(jīng)典的MS病理改變不同。廣泛的少突膠質(zhì)細

2、胞凋亡是新?lián)p傷形成時最早出現(xiàn)的病理改變之一，在新?lián)p傷形成的病理過程中，首先出現(xiàn)少突膠質(zhì)細胞凋亡，隨后在凋亡區(qū)出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞聚集，此時髓鞘形態(tài)完整，無明顯損傷。在此過程之后才出現(xiàn)T、B淋巴細胞的浸潤和吞噬斑塊的形成、軸突明顯損傷等典型病理改變。但引起少突膠質(zhì)細胞凋亡的原因目前尚不清楚。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS的經(jīng)典動物模型，在EAE模型

3、中神經(jīng)細胞的凋亡模式以及與典型病理改變之間的關(guān)系尚不明確。闡明MS/EAE早期病理事件的表達模式對明確MS/EAE的發(fā)病機制以及尋找早期有效的干預(yù)手段都有十分重要的意義。
　　目前發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷是MS病理過程重要的非免疫損傷機制，MS存在線粒體功能失調(diào)，以及更高的能量需求，而且線粒體損傷與細胞凋亡密切相關(guān)，但線粒體損傷是否參與了MS/EAE發(fā)病早期的病理過程尚不十分清楚。
　　姜黃素是一種植物多酚，目前已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗

4、氧化等保護作用，在EAE中也展現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護作用。但在MS/EAE中能否保護線粒體，抑制EAE早期細胞凋亡的發(fā)生，及其神經(jīng)保護的機制尚不明確。
　　目的:
　　本實驗通過構(gòu)建C57 BL/6小鼠EAE模型，探索EAE免疫后整個病理過程中CNS細胞凋亡及線粒體損傷情況，試圖進一步明確MS/EAE在出現(xiàn)脫髓鞘等典型病理改變前的最初事件表達情況及其在整個病理過程中表達模式的動態(tài)變化以及與脫髓鞘等典型病理改變的關(guān)系，并探討引起M

5、S/EAE最初病理事件的原因和機制。驗證姜黃素對EAE小鼠的神經(jīng)保護作用，并探討姜黃素能否通過保護線粒體損傷抑制EAE小鼠神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，進一步闡明姜黃素通過線粒體保護，抑制線粒體凋亡途徑引起的神經(jīng)細胞凋亡的病理機制。
　　方法:
　　1.成功構(gòu)建C57 BL/6小鼠EAE模型，根據(jù)免疫后時間分為3d、7d、16d（急性期）、30d（慢性期）四組及正常組小鼠，采用TUNEL原位凋亡檢測、透射電鏡、ATP水平檢測、免疫熒光

6、雙標(biāo)等技術(shù)動態(tài)觀察EAE小鼠CNS神經(jīng)細胞凋亡及線粒體損傷的情況及其在免疫后不同時間點表達變化情況。觀察凋亡、線粒體損傷程度與髓鞘損傷、軸突破壞等典型病理改變之間的聯(lián)系。
　　2.C57BL/6小鼠分成正常組、EAE模型組、對照組、姜黃素組，其中后三組又根據(jù)EAE病程不同分成發(fā)病急性期(16d)與慢性期(30d)兩組，姜黃素組自免疫日起每日腹腔注射姜黃素（200mg/kg/d）。神經(jīng)功能評分觀察各組小鼠神經(jīng)功能變化，H-E染色觀察

7、脊髓炎性細胞浸潤情況，勒克斯堅牢藍(Luxol fast blue，LFB)染色觀察脊髓髓鞘損傷程度，Bielschowsky銀染觀察脊髓軸突損傷水平，免疫組化法觀察星形膠質(zhì)細胞激活情況，TUNEL原位凋亡檢測及caspase-3免疫組化觀察各組小鼠凋亡水平的不同。
　　3.C57BL/6小鼠分成正常組、EAE模型組、對照組、姜黃素組，其中后三組又根據(jù)免疫后時間點分成3d、7d、16d、30d組。通過westernblot觀察不同

8、時間點caspase-3、caspase-9、Cytochrome c(cyt-c)、MBP、NRF2的表達水平，ATP水平檢測試劑盒檢測各組ATP表達水平的動態(tài)表達情況。動態(tài)研究姜黃素通過保護線粒體，抑制線粒體損傷途徑介導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)機制。
　　結(jié)果:
　　1.TUNEL原位凋亡檢測示EAE小鼠免疫后3d時脊髓即檢測到細胞凋亡的發(fā)生，細胞凋亡水平以急性期16d時為最高(P＜0.05)。經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)染色證實，3d時

9、凋亡的細胞為少突膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元。同時免疫后3d時已出現(xiàn)線粒體ATP水平的下降(P＜0.01)，ATP水平至急性期16d時為最低(P＜0.05)。透射電鏡證實免疫后3d時脊髓組織已出現(xiàn)線粒體腫脹、線粒體嵴被擠向周圍等線粒體形態(tài)異常，而此時髓鞘及軸突形態(tài)無異常。至免疫后16d時電鏡可見到脊髓髓鞘板層破壞，軸漿萎縮等典型病理變化，并伴隨線粒體腫脹、空泡樣變甚至溶解等線粒體廣泛病變。
　　2.姜黃素組EAE小鼠較EAE模型組神經(jīng)功能顯著

10、提高(P＜0.05)，發(fā)病時間明顯延后(P＜0.05)。H-E染色示姜黃素組炎性細胞浸潤比同時間點模型組明顯減輕(P＜0.05)，無“血管袖套樣”典型炎性病變。LFB染色示姜黃素組髓鞘脫失程度與模型組比較輕，髓鞘缺失區(qū)域明顯減少(P＜0.05)。Bielschowsky銀染示姜黃素組在急性期及慢性期軸突損傷情況均較同時間點模型組為輕。免疫組化示姜黃素組免疫后16d時星形膠質(zhì)細胞激活水平明顯低于同時間點模型組(P＜0.01)，但于免疫后3

11、0d時兩組并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。TUNEL原位凋亡及caspase-3檢測示姜黃素能顯著抑制急性期及慢性期EAE小鼠神經(jīng)細胞凋亡水平(P＜0.05)。
　　3.western blot示EAE模型組髓鞘MBP水平自免疫后16d開始顯著降低，姜黃素能明顯抑制MBP水平的降低(P＜0.05)，抑制髓鞘損傷。姜黃素組在免疫后7d、16d、30d時均能明顯抑制凋亡標(biāo)記物caspase-3的表達(P＜0.05)以及線粒體ATP

12、水平的降低(P＜0.05)。
　　4.EAE模型組線粒體凋亡途徑關(guān)鍵蛋白cyt-c、caspase-9的表達于免疫后7d時顯著增高(P＜0.01)，此后一直持續(xù)高表達水平(P＜0.01)。與EAE組比較，姜黃素能顯著抑制cyt-c、caspase-9表達水平的增高(P＜0.05)。與正常組比較，EAE模型組NRF2水平顯著增加見于免疫后7d時(P＜0.05)，此后一直持續(xù)高表達;而與同時間點模型組比較，姜黃素組NRF2表達水平更高

13、(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.EAE小鼠免疫后三天即發(fā)生了神經(jīng)細胞凋亡，凋亡細胞為少突膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元。細胞凋亡發(fā)生于脫髓鞘、軸突損傷等典型病理改變出現(xiàn)之前，是EAE的早期病理事件，且凋亡水平與EAE的疾病嚴(yán)重程度呈一致性。
　　2.姜黃素可通過抑制細胞凋亡的程度、抑制線粒體損傷程度、抑制炎性細胞浸潤、軸突損傷等發(fā)揮對EAE小鼠的神經(jīng)保護作用。
　　3.姜黃素通過保護線粒體功能，抑制線粒體凋亡途徑關(guān)鍵蛋