殺傷性人工抗原提呈細胞治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的初步研究.pdf

1、多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘性疾病，主要病理改變?yōu)榇竽X半球的側腦室旁、腦干以及脊髓處髓鞘脫失，并有不同程度的炎性細胞浸潤?，F(xiàn)已普遍認為該病主要是由自身反應性T細胞所介導的針對CNS髓鞘自身抗原的自身免疫病，其中CD4+T細胞在MS中其關鍵作用，CD8+T細胞也有一定致病性。目前的免疫抑制藥物都不能有效治愈MS，有時患者還會出現(xiàn)反應欠佳或不能耐受，嚴重影響了患者的生活質量。選擇性

2、清除或抑制同種反應性T細胞是治療自身免疫病等的理想策略之一，因為它能避免免疫抑制劑所導致的患者整體免疫功能損傷。因此，幾十年來人們一直在探索各種特異性免疫療法，殺傷性人工抗原提呈細胞(Killer artificialantigen-presenting cell，KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使現(xiàn)有的抗原提呈細胞表面表達Fas配體，并通過細胞膜上的pMHC分子靶向結合抗原特異性T細胞，同時通過膜上的FasL與

3、活化后T細胞膜上的Fas分子結合從而誘導T細胞凋亡。這種策略對同種移植排斥、自身免疫病及變態(tài)反應等的治療都有很多成功的報道。近年來人們開始使用非細胞性載體，如磁珠、膠乳微球等制備KaAPC。其基本原理是以pMHC多聚體為靶向抗原，與anti-Fas共包被細胞大小的磁珠或膠乳微球，在體外靶向殺傷抗原特異T細胞。本課題組前期利用可在人體內生物降解、無毒性、有組織相容性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic

4、acid，PLGA)微球制備KaAPC，在體外和皮膚移植鼠體內成功實施了抗原特異性T細胞的靶向殺傷，有效延緩同種皮膚移植物的成活期。
　　實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)是研究多發(fā)性硬化的理想動物模型。本研究利用PLGA微球共吸附以裝載有MOG兩種抗原表位的H-2Db/MOG40-54二聚體和H-2 I-Ab/MOG35-55多聚體，同時共價偶聯(lián)

5、三種T細胞反應的負調節(jié)分子（anti-Fas mAb、PD-L1-Ig、TGF-β1）和抗吞噬分子（CD47-Ig），制備多功能的新型KaAPCs，初步研究其治療小鼠EAE的效果。
　　結果:
　　1)用21只6-8周雌性C57BL/6小鼠，隨機分為3組，即PBS組、BCG組和MOG組，9只/組。將MOG35-55多肽與完全弗氏佐劑CFA等體積混合后充分乳化(BCG最終濃度10mg/ml)，皮下多點注射MOG組小鼠（MOG4

6、00μg/0.2ml/只）;PBS組和BCG組則分別用PBS和BCG代替MOG多肽，同樣行皮下多點注射。同時，在第0天，BCG組和MOG組每只小鼠經腹腔注射0.2mlPTX（500ng/只），并在48小時后重復注射一次。結果顯示，MOG組所有小鼠從造模第7天后陸續(xù)發(fā)病，至第11天為發(fā)病初期，第18天為發(fā)病高峰，至第40天為慢性期;HE染色顯示腦和脊髓多區(qū)域炎性細胞在發(fā)病初期明顯增加，高峰期最多;免疫組化顯示MBP蛋白從發(fā)病初期即開始減少

7、，至發(fā)病高峰期最少;GFAP蛋白則相反，發(fā)病初期陽性細胞增多，高峰期最多，慢性期趨于平穩(wěn);流式檢測顯示:淋巴結中MOG35-55特異性CD4+T細胞頻率和MOG40-54特異性CD8+T細胞頻率在發(fā)病初期增高，高峰期最高，慢性期次之;ELISPOT顯示:脾細胞群中對MOG35-55和MOG40-54多肽刺激有反應活性的T細胞頻率在發(fā)病初期最高，高峰期次之，慢性期最低，與病程中特異性CD4+T和CD8+T的數(shù)量水平不一致。
　　2)

8、利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能化的、直徑4.5μm的PLGA微球。掃描電鏡、Zeta電位和粒徑分析顯示其具有良好的表征:呈規(guī)則球形，表面完整，61.2％的微球直徑在4.0-5.0μm，平均Zeta(ξ-)電位為36.3mV+6.11 mV，分散性好，表面氨基基團豐富;單抗染色和流式分析證實:所制備的KaAPCs成功共展示了相應的H-2Db-Ig二聚體和H-2I-Ab-Ig多聚體、anti-Fas及其他分子，微球表面的分子表型正確。

9、
　　3)將制備好的KaAPCs輸注治療小鼠EAE模型，在發(fā)病的第11天，第14天和第17天分別給予KaAPCs尾靜脈注射，每次1×107 PLGA/ml/只。初步臨床觀察和神經功能評分顯示:KaAPCs治療組小鼠在第三次治療后開始出現(xiàn)明顯的臨床緩解癥狀，其他PBS治療組、空白PLGA治療組和無關抗原肽特異性KaAPCs治療組均未出現(xiàn)癥狀減輕跡象，初步提示KaAPCs治療EAE的有效性。
　　結論:
　　成功制備EAE