人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心力衰竭患者CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響.pdf

1、背景：心力衰竭(heart failure HF)是各種心臟疾病的最終結(jié)局，具有較高的致殘率和致死率，大大減低了患者的生活質(zhì)量，目前研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)功能異常與其發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群中表型和功能特異的一組細(xì)胞，具有免疫無能性和免疫抑制性的功能，這種功能使其能夠抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的過度激活，在自身免疫病、腫瘤、移植物抗宿主?。╣raft-versus-host diseaseGV

2、HD）等疾病的治療中發(fā)揮重要作用。目前研究證實(shí)無論何種病因?qū)е碌腍F，患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例均較正常人群顯著下降，且其下降程度與HF嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)，而給予HF鼠模型輸注外源性 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞則可以延緩、逆轉(zhuǎn)心衰進(jìn)展，提示CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例下降可能參與了HF的發(fā)生、發(fā)展，所以可以將提升CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例作為HF免疫治

3、療的一個(gè)新靶點(diǎn)。但Foxp3作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,位于細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)較為復(fù)雜,CD127即IL-7受體,位于細(xì)胞表面，較容易定量測(cè)定，且研究證明CD127的低表達(dá)與Foxp3相關(guān)，與Foxp3相比，CD127被認(rèn)為更能作為CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異的表面分子標(biāo)記。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells MSCs)是一類具有免疫抑制性的多能干細(xì)胞，其通過抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖，維持樹突狀細(xì)胞（dendritic c

4、ell DC）非成熟狀態(tài)，改變輔助性CD4+T細(xì)胞亞群的表型，改變CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能等發(fā)揮免疫抑制功能。研究證實(shí)，MSCs可以劑量依賴性抑
　　制植物凝集素（phytohemagglutinin PHA）、抗CD3/CD28、同種異型抗原刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells PBMC）或富集的CD3+、CD4+或CD8+淋巴細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制仍

5、存在爭(zhēng)議。目前研究表明MSCs能夠刺激活化的人外周血單個(gè)核細(xì)胞，鼠的脾細(xì)胞，分離純化的T-CD4+細(xì)胞產(chǎn)生CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，部分學(xué)者認(rèn)為MSCs抑制T淋巴細(xì)胞增殖是通過誘導(dǎo)其產(chǎn)生CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞而間接完成的。目前關(guān)于MSCs對(duì) HF患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的影響未見報(bào)道,且既往對(duì)MSCs的免疫調(diào)節(jié)研究多針對(duì)骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mes

6、enchymal stem cells BMSCs），對(duì)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells hUC-MSCs）的關(guān)注較少，而我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞可改善HF患者臨床癥狀，提高其預(yù)后，所以本研究選取hUC-MSCs為MSCs來源，初步探討其對(duì)HF患者PBMC增殖的影響及其對(duì)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞產(chǎn)生的影響及其相關(guān)機(jī)制，為hU

7、C-MSCs治療 HF提供新的免疫學(xué)理論依據(jù)。
　　第一節(jié)、hUC-MSCs對(duì)HF患者PBMC增殖能力的影響
　　目的：檢測(cè)hUC-MSCs對(duì)PHA刺激下HF患者PBMC增殖能力的影響。
　　方法：
　　1．hUC-MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：采用組織團(tuán)塊法分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志物，MTT法測(cè)定其生長曲線。
　　2．采用密度梯度離心法分離HF患者PBMC。
　　3．hUC-

8、MSCs與PBMC共培養(yǎng)，分為7組：A組：PBMC+PHA B組：PBMC+PHA+2×105個(gè)/ml hUC-MSCs C組：PBMC+PHA+2×104個(gè)/ml hUC-MSCs D組:PBMC+PHA+2×103個(gè)/ml hUC-MSCs E組:2×105個(gè)/ml hUC-MSCs F組:2×104個(gè)/ml hUC-MSCs G組：2×103個(gè)/ml hUC-MSCs,于共培養(yǎng)72h后用MTT（methlthiazolyltetr

9、azolium）法檢測(cè)各組吸光值A(chǔ)，并計(jì)算增殖抑制率。
　　4．將HF患者PBMC重懸于hUC-MSCs條件培養(yǎng)基，共分為3組：A組：RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10％FBS）培養(yǎng)組B組：hUC-MSCs培養(yǎng)上清（含10%FBS）+RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組（1：1）C組：hUC-MSCs培養(yǎng)上清（含10%FBS）培養(yǎng)組，于共培養(yǎng)72h后用MTT法檢測(cè)各組吸光值A(chǔ)，并計(jì)算增殖抑制率。
　　結(jié)果：
　　1．P3代

10、hUC-MSCs生長良好，細(xì)胞貼壁后高倍鏡下見細(xì)胞呈長梭形，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞表面特異性抗原，結(jié)果顯示高表達(dá)CD29、CD44，低表達(dá)CD34、CD45。
　　2．hUC-MSCs與HF患者PBMC共培養(yǎng)72小時(shí)后，與A組單獨(dú)PBMC培養(yǎng)組相比，加入不同濃度hUC-MSCs的培養(yǎng)組B組、C組、D組PBMC增殖受到不同程度抑制，抑制率分別74.92±1.17（%）、51.56±4.36（%）、25.24±2.24（%），差異有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義（p<0.01）。
　　3．HF患者PBMC在hUC-MSCs條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)后，與A組正常培養(yǎng)組相比，B組、C組 PBMC增殖受到不同程度抑制，抑制率分別是25.82±2.26（%）、39.52±4.12（%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。
　　結(jié)論：hUC-MSCs呈現(xiàn)劑量依賴性抑制PHA刺激下HF患者 PBMC增殖，hUC-MSCs條件培養(yǎng)基同樣可抑制此過程，但抑制程度較輕，仍提示hUC-MSCs具

12、有固有免疫分泌能力參與此抑制過程。
　　第二節(jié)、hUC-MSCs對(duì)HF患者CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞產(chǎn)生的影響
　　目的：檢測(cè)hUC-MSCs對(duì)HF患者外周血中CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞產(chǎn)生的影響。
　　方法：
　　1．同第一節(jié)方法分離、培養(yǎng)、鑒定hUC-MSCs和分離HF患者PBMC。
　　2．hUC-MSCs與HF患者PBMC共培養(yǎng),分為4組A組：?jiǎn)为?dú)PBMC

13、培養(yǎng)組B組：PBMC+2×105個(gè)/ml hUC-MSCs C組：PBMC+2×104個(gè)/ml hUC-MSCs D組:PBMC+2×103個(gè)/ml hUC-MSCs，于共培養(yǎng)72h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞比例。
　　3．將分離的HF患者PBMC重懸于hUC-MSCs條件培養(yǎng)基，共分為3組：A組：RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS）培養(yǎng)組B組：hUC-MSCs培養(yǎng)上

14、清（含10%FBS）+RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組（1：1）C組：hUC-MSCs培養(yǎng)上清（含10%FBS）培養(yǎng)組，于共培養(yǎng)72h后運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CD4+CD25+CD127lowTreg/CD4+T細(xì)胞比例。
　　結(jié)果：
　　1．hUC-MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定，PBMC的分離同第一節(jié)
　　2．hUC-MSCs與HF患者PBMC共培養(yǎng)72小時(shí)后，與A組相比，B組、C組、D組CD4+CD25+CD127lo

15、wTreg/CD4+T細(xì)胞比例呈現(xiàn)hUC-MSCs劑量依賴性升高(5.25±0.66（%）、4.34±0.45（%）、3.45±0.22（%）vs2.63±0.21（%)P<0.01)。
　　3．HF患者PBMC在hUC-MSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)后，與A組相比，B組、C組CD4+CD25+CD127lowTreg/CD4+T細(xì)胞比例有所上升(3.69±0.30（%）、3.20±0.25（%）vs2.64±0.21（%）P<0