CD200-CD200R通路在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞中的作用.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSC)是一種非造血系成體多能干細(xì)胞，能夠抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞活性，影響B(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)的分化及成熟。近年一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSC能夠減低GVHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)甚至治療急性GVHD，其減輕GVHD反應(yīng)的機(jī)制可能通過(guò)抑制DC的成熟及抗原提呈功能。樹(shù)突狀細(xì)胞作為功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)

2、胞，在移植免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制DC的分化、成熟及抗原提呈功能，其機(jī)制主要包括可溶性因子及細(xì)胞間接觸等兩個(gè)方面。可溶性因子是MSC調(diào)節(jié)DC功能的重要機(jī)制，但部分研究表明細(xì)胞間接觸途徑可能也起到重要的作用。
　　 CD200是近年新發(fā)現(xiàn)的與免疫排斥相關(guān)的分子，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞。Kawasaki等人發(fā)現(xiàn)，CD200表達(dá)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。Khatri等發(fā)現(xiàn)，CD200R存在于DC上，CD200與CD200R通路通

3、過(guò)細(xì)胞間接觸，傳遞抑制信號(hào)，阻止DC成熟，抑制DC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。由此設(shè)想，抑制性免疫調(diào)控分子CD200是BM-MSC抑制DC成熟及功能的作用機(jī)制之一。研究BM-MSC相關(guān)的細(xì)胞間接觸途徑，能夠更全面了解BM-MSC的作用機(jī)制，有利于在造血干細(xì)胞移植中發(fā)揮BM-MSC抑制aGVHD的作用，提高移植療效。
　　 第一部分 CD200分子在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)
　　 方法:1.分離、培養(yǎng)、鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用F

4、ACS及RT-PCR方法檢測(cè)P2-P6 BM-MSC的CD200表達(dá)。2.將不同來(lái)源PBMCs中加入PHA，建立體外免疫應(yīng)答模型，并將BM-MSC加入其中，72小時(shí)后FACS檢測(cè)BM-MSC表面CD200表達(dá)的變化。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS11.5軟件包，均數(shù)間比較采用OneWay ANOVA檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:1.CD200在BM-MSC P2-P5呈逐漸增加趨勢(shì)，至P6表達(dá)增加明顯，

5、 FACS檢測(cè)CD200陽(yáng)性率分別為P2(17.35％±10.38％,n=11)、P3(26.35％±19.79％，n=11)、P4(34.20％±21.29％，n=11)、P5(40.44％±26.28％，n=11)、P6(50.19％±26.29％,n=11)；P2與P6差異明顯(P=0.007)，且與性別、年齡(P＞0.05)無(wú)關(guān)。RT-PCR方法檢測(cè)CD200 RNA量相對(duì)表達(dá)率分別為P2(0.33％±0.26％,n=5)、P3

6、(0.48％±0.52％,n=7)、P4(0.88％±0.68％,n=8)、P5(1.34％±0.96％,n=7)、P6(1.99％±1.74％,n=7)；P2與P6差異明顯(P=0.008)。2.PHA刺激PBMC活化增殖，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD值)，PBMC+PHA組高于PBMC組([0.83±0.04] vs[0.44±0.01]，P=0.000)，MSC+PBMC+PHA組高于MSC+PBMC組([0.62±0.03]vs[

7、0.44±0.01]，P=0.000)。而與MSC+PBMC組相比，PHA刺激PBMC活化增殖后促進(jìn)MSC表面的CD200分子表達(dá)上調(diào)([44.842±12.958]vs[33.742±7.938]，P=0.017)。
　　 第二部分 CD200-CD200R通路在BM-MSC調(diào)節(jié)DC功能中的作用
　　 方法:1、分離人外周血PBMC，參照髓樣DC培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基中加入IL-4/GM-CSF，培養(yǎng)第5天得未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞

8、(imDC，高表達(dá)CD1a，低表達(dá)CD14)，再加入LPS，第7天得成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mDC，高表達(dá)CD83、CD86)。在DC培養(yǎng)的第1天加入表達(dá)CD200的BM-MSC，部分實(shí)驗(yàn)組加入抗CD200阻斷性抗體，培養(yǎng)第5天FACS檢測(cè)imDC免疫表型。2、在DC培養(yǎng)的第5天加入表達(dá)CD200的BM-MSC，部分實(shí)驗(yàn)組加入抗CD200阻斷性抗體，然后加入LPS，第7天收獲成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測(cè)mDC免疫表型：混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)mDC

9、對(duì)PBMC增殖的影響；ELISA法檢測(cè)mDC培養(yǎng)上清中IL-12的濃度。3、取同株不同CD200陽(yáng)性率BM-MSC P2/P5(P2 CD200陽(yáng)性率小于25％，P5 CD200陽(yáng)性率大于80％)與imDC共培養(yǎng)，加入LPS，第7天收獲mDC。檢測(cè)項(xiàng)目參照實(shí)驗(yàn)2。4、應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組以上組間資料比較采OneWay ANOVA檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05

10、。
　　 結(jié)果;1與單純PBMCs組相比，BM-MSCs與PBMCs共培養(yǎng)5天后，細(xì)胞表面分子未趨向imDC表型：(CD14：[35.13％±14.75％]vs[5.05％±3.66％]，P=0.005；CD1a：[11.15％±5.22％]vs[79.86％±4.59％]，P=0.000)。而加入抗CD200阻斷性抗體，不影響MSC抑制PBMC向imDC分化的作用，imDC表面免疫分子未發(fā)生明顯變化(CD14：[48.25％±

11、12.57％]vs[35.13％±14.75％]，P=0.138；CD1a：[10.52％±12.91％]vs[11.15％±5.22％]，P=0.919)。2在imDC向mDC成熟階段加入BM-MSC，則mDC表面共刺激分子表達(dá)降低：(CD83：[46.34％±6.77％]vs[78.31％±6.51％]，P=0.002；CD86：[81.42％±8.61％]vs[94.04％±2.62％]，P=0.026)；對(duì)PBMC的刺激能力減弱

12、(OD值：[0.767±0.036]vs[0.944±0.017]，P=0.000)；分泌IL-12減少([216pg/ml±12pg/ml]vs[346pg/ml±7pg/ml]，P=0.000)。同時(shí)加入抗CD200阻斷性抗體，則mDC成熟表型表達(dá)較BM-MSC抑制組有所增加(CD83：[65.95％±13.28％]vs[46.34％±6.77％]，P=0.039; CD86：[92.96％±3.42％]vs[81.42％±8.61

13、％]，P=0.04)；對(duì)PBMC增殖的刺激能力增強(qiáng)(OD值：[0.859±0.024]vs[0.767±0.036]，P=0.001)；分泌的IL-12增加([272pg/ml±13pg/ml]vs[216pg/ml±12pg/ml]，P=0.000)。3取同株不同CD200陽(yáng)性率的BM-MSC與imDCs共培養(yǎng)，加入LPS誘導(dǎo)imDC成熟。與CD200低表達(dá)組相比，CD200高表達(dá)組mDC成熟標(biāo)記表達(dá)減弱：(CD83：[55.58％±

14、0.46％]vs[68.81％±8.49％]，P=0.017；CD86.[74.34％±1.28％]vs[81.86％±3.27％]，P=0.005)；對(duì)PBMCs增殖的抑制率減弱(OD值：[0.773±0.011]vs[0.870±0.004]，P=0.000)；分泌細(xì)胞因子有所減弱(IL-12：[226±6.8]ng/L vs[272±8.0]ng/L，P=0.001)。
　　 結(jié)論:1 CD200分子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)