間充質干細胞體外培養(yǎng)方法改良及其誘導調節(jié)性樹突狀細胞的機制.pdf

1、目的：間充質干細胞是一種具有自我復制和多向分化潛能的干細胞。其在臨床上應用廣泛，可用于治療GVHD（Graft-versus-host disease）、促進造血重建等。此外，間充質干細胞還可以抑制異種抗原刺激所致的淋巴細胞反應、促進調節(jié)性 T細胞生成等，具有廣泛的免疫調節(jié)作用。并且，近期研究發(fā)現(xiàn)，其不但對特異性免疫應答具有重要的調節(jié)作用，對非特異性免疫應答細胞亦具有調節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，其可能參與“調節(jié)性樹突狀細胞”的形成，但是目前對其

2、作用機制尚不明確。間充質干細胞已成為干細胞領域研究的重點，具有廣闊的應用前景，但是目前常用的體外培養(yǎng)間充質干細胞的方法容易導致其干性降低、細胞凋亡以及衰老。因此，本課題擬尋找一種可以維持間充質干細胞干性，降低其凋亡、延緩衰老進程的培養(yǎng)方法；并對其與樹突狀細胞之間相互作用的機制進行初步探討。
　　方法：將殼聚糖溶解于醋酸后涂覆于培養(yǎng)板表面，在60℃烘箱中完全烘干，形成殼聚糖薄膜。后將分離出的小鼠骨髓間充質干細胞以同等密度接種于涂覆有

3、殼聚糖的培養(yǎng)板和普通未經處理的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)5天后收集兩組細胞檢測其干性相關標志分子CD44、Sca-1的表達情況；分別用PI-Annexin V和Hochest33342進行染色和標記，用流式細胞儀和熒光顯微鏡分析和觀察細胞凋亡的情況；最后用β-Gal細胞衰老染色試劑盒進行染色，在光學顯微鏡下觀察細胞的衰老情況。通過上述實驗分析三維球體培養(yǎng)方式對間充質干細胞干性、凋亡和衰老的影響。為了研究間充質干細胞與樹突狀細胞之間相互作用的機制，我

4、們收集生長狀態(tài)良好的間充質干細胞培養(yǎng)上清，從中分離出外泌體并添加到樹突狀細胞的培養(yǎng)基中，通過ELISA的方法檢測樹突狀細胞分泌的IL-10的情況。將與外泌體共培養(yǎng)48h后的樹突狀細胞與小鼠淋巴細胞共培養(yǎng)72h，之后用流式細胞儀分析淋巴細胞中CD4+CD25+細胞即調節(jié)性T細胞的比例以及分析T細胞增殖能力的變化。通過對樹突狀細胞分泌IL-10以及其激活T細胞能力的變化進行分析，探討外泌體是否參與間充質干細胞對樹突狀細胞的調節(jié)。
　　

5、結果：間充質干細胞在殼聚糖薄膜上培養(yǎng)1天即開始出現(xiàn)聚集的趨勢，到第3天即呈半懸浮的三維球體狀態(tài)。通過各個實驗結果發(fā)現(xiàn)：三維球體狀態(tài)下生長的間充質干細胞其干性相關分子CD44和Sca-1的表達比例要明顯高于對照組，很好的保持了其干性；流式細胞儀結果顯示的凋亡細胞比例以及在熒光顯微鏡
　　結論：間充質干細胞近年來備受關注，目前在組織工程和細胞治療領域均有廣泛的應用。但在目前的培養(yǎng)條件下容易過早的喪失干性、凋亡和衰老，從而嚴重影響其應用