CD200在羊膜間充質(zhì)干細胞表面的表達及對小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景：
　　隨著干細胞移植技術(shù)的逐漸成熟,細胞治療在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用引起廣泛關(guān)注。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是現(xiàn)如今應(yīng)用較多的一類具有多向分化能力的成體干細胞,近年研究顯示:從人羊膜中提取而來的羊膜間充質(zhì)干細胞(Amniotic mesenchymal stem cells,AMSCs),由于其相對于胚胎干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞,具有來源廣泛、取材方便、易擴增、多向分化潛能以及免

2、疫原性低等優(yōu)點,同時又避開了胚胎干細胞來源缺乏、倫理道德和法律限制等問題,是目前細胞治療的一種理想的種子細胞來源。越來越多的動物實驗表明,移植羊膜間充質(zhì)干細胞可以改善神經(jīng)功能缺損癥狀,但具體作用機制尚需進一步探討。
　　小膠質(zhì)細胞(microglia MI)是目前公認的對腦部損傷、炎性以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進行反應(yīng)的效應(yīng)細胞,其主要特征是容易被任何形式的腦損傷或疾病所激活,在多種神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮著損傷和修復(fù)的雙重作用。活化的

3、小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮著包括吞噬、免疫炎癥反應(yīng)、細胞毒性和通過抗原提呈T淋巴細胞的調(diào)節(jié)等作用。MI被激活后釋放的多種細胞因子可引起不同程度的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡,構(gòu)成了“病理級聯(lián)”效應(yīng)。由此我們推測,在CNS早期的炎癥或損傷過程中如果能調(diào)控MI的活化程度將對控制整個病理或損傷過程非常有利。
　　CD200屬于白細胞分化抗原,是一種細胞表面的跨膜糖蛋白,其表達范圍較廣,主要在神經(jīng)細胞、胸腺細胞、B細胞T細胞、血管

4、內(nèi)皮細胞等。有研究表明CD200可以表達在羊膜間充質(zhì)干細胞表面。CD200R與其配體CD200均屬于免疫球蛋白超家族,CD200R主要表達在包括小膠質(zhì)細胞在內(nèi)的單核巨噬細胞系統(tǒng)和少量的T細胞上。CD200與CD200R通過細胞間接觸,誘導(dǎo)免疫耐受,傳遞抑制性信號。研究發(fā)現(xiàn),CD200能夠下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài),使小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞因子減少。由此我們設(shè)想羊膜間充質(zhì)干細胞也有可能通過這種途徑來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)MI的活化,

5、進而控制由其觸發(fā)的一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,從而發(fā)揮細胞治療作用。
　　目的:
　　本實驗研究CD200-CD200R相關(guān)的細胞間接觸途徑,探索CD200在羊膜間充質(zhì)干細胞對小膠質(zhì)細胞免疫調(diào)節(jié)中的作用,以期更全面了解羊膜間充質(zhì)干細胞的作用機制。本文從以下及部分進行了論述。
　　第一部分羊膜間充質(zhì)干細胞及小膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　方法：
　　1.AMSCs的體外培養(yǎng)及鑒定,分別觀察其原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細

6、胞生長情況并作出生長曲線;AMSCs的體外誘導(dǎo)分化實驗
　　2.MI的體外培養(yǎng)、純化及鑒定
　　3.MI的活化
　　結(jié)果：
　　1.成功由羊膜組織分離、培養(yǎng)得到的AMSCs具有MSCs的形態(tài)和細胞表面標志,符合MSCs的生長、增殖特點,流式細胞儀檢測顯示該細胞表達CD73、CDl05,不表達CD45和HLA-DR。AMSCs誘導(dǎo)前不表達NSE,弱表達GFAP,經(jīng)誘導(dǎo)后細胞強表達神經(jīng)細胞特異性標記物NSE、GFAP

7、。
　　2.成功分離、純化的MI形態(tài)上細胞體呈細長或橢圓,從胞體發(fā)出細小而有分支的突起。CD68免疫熒光染色陽性的細胞達到細胞總數(shù)的95％以上,MI純度較高。
　　3.MI經(jīng)LPS刺激后活化,細胞呈阿米巴樣外觀,MAC-1免疫熒光陽性,靜息狀態(tài)的MI自身能分泌微量的TNF-α和IL-6,激活后上清液中炎性因子的含量明顯升高,激活前后差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　第二部分羊膜間充質(zhì)干細胞體外調(diào)控小膠質(zhì)細胞活性

8、及其可能機制研究
　　方法：
　　1.免疫熒光染色法檢測AMSCs表面CD200的表達;ELISA檢測P2-P6 AMSCs上CD200的表達。
　　2.免疫熒光染色法檢測MI表面CD200R的表達;ELISA檢測P1-P4 MI上CD200R的表達。
　　3.AMSCs與MI體外共培養(yǎng)及抗CD200抗體阻斷實驗。建立AMSCs和MI共培養(yǎng)體系,實驗分組如下:MI組、MI+LPS組、MI+LPS+AMSCs組、M

9、I+LPS+AMSCs+抗CD200抗體組、MI+LPS+AMSCs transwell組,共培養(yǎng)48h后觀察各組細胞的形態(tài);ELISA檢測各組上清中炎性因子TNF-α和IL-6的表達,免疫熒光法、ELISA檢測各組細胞表面CD200R的表達。
　　結(jié)果：
　　1.AMSCs表達CD200,且P2-P6 CD200的表達呈遞增趨勢,至P6表達增加明顯,P2與P6差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。
　　2.MI表達C

10、D200R,CD200R在各代MI表面均有表達,與P1相比,其余各代OD值均升高,但各代間相比無顯著差異(P>0.05)。
　　3.在LPS作用下上清液中TNF-α和IL-6的分泌量較MI組顯著增加,而在LPS+MI+AMSCs組中,當有AMSCs存在時,兩種炎性因子的分泌量呈明顯下降趨勢,LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組培養(yǎng)48h后,兩種細胞因子分泌量較LPS+MI+AMSCs組上升,但仍低于LPS+MI組;Tran

11、swell組兩種細胞因子分泌量較LPS+MI+AMSCs組明顯升高,與LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組比較無明顯差異。
　　4.免疫熒光法可見每組均有CD200R陽性細胞,MI+LPS組較MI組熒光強度稍減弱,MI+LPS+AMSCs組CD200R比MI+LPS組明顯增強,抗CD200抗體組、Transwell組較MI+LPS組無明顯差異。
　　5.MI+LPS組CD200R的表達較MI組有所減少,當有AMSCs

12、存在時,CD200R的表達呈顯著上升趨勢,LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組培養(yǎng)48h后,CD200R的表達較LPS+MI+AMSCs組下降,但與LPS+MI組比較無明顯差異,Transwell組CD200R的表達較LPS+MI+AMSCs組明顯降低,與LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組比較差異不明顯。
　　統(tǒng)計學(xué)方法：
　　所有統(tǒng)計分析均用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(x±s)表