羊膜間充質(zhì)細(xì)胞在Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡中的免疫調(diào)控作用.pdf

1、研究背景：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)俗稱老年性癡呆(senile dementia),是老年人中常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)退行性疾病。其病因復(fù)雜,多數(shù)研究表明β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)在阿爾茨海默病(AD)中起著重要作用,Aβ作為慢性刺激物質(zhì)在腦內(nèi)逐漸沉積形成神經(jīng)炎斑。它可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞(microg

2、lia,MI)的非特異性局灶性炎性反應(yīng),并以此導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡?？梢?Aβ沉積介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是導(dǎo)致AD腦內(nèi)神經(jīng)元丟失的重要原因。
　　由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,使其在治療方面存在極大的困難,很多治療AD的化學(xué)藥物僅僅能改變疾病的癥狀,卻不能抑制疾病的進(jìn)展。隨著高新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,尤其是干細(xì)胞移植技術(shù)的不斷完善,給治療AD提供了新的策略和契機(jī)。
　　研究發(fā)現(xiàn)來源于胎膜的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(Amniotic mesench

3、yme(stem) cells, AMSCs)不僅具有干細(xì)胞特性、免疫原性較弱,本身還具有免疫調(diào)節(jié)特性,能夠抑制免疫細(xì)胞的增殖而不引起其免疫反應(yīng)?；贛I在AD中的作用,我們?cè)O(shè)想羊膜間充質(zhì)細(xì)胞也可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞-MI的過度活化,進(jìn)而調(diào)控由其觸發(fā)的一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,從而起到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞特性及其對(duì)Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫抑制作用,并進(jìn)一步探討Aβ

4、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)羊膜間充質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)控后對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　1.3種細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定:
　　采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),進(jìn)行羊膜間充質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分離及培養(yǎng);然后用免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析其表型和神經(jīng)生物學(xué)特性。
　　2.AMSCs與MI共培養(yǎng)體系的建立:
　　羊膜間充質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均調(diào)整濃度為1.0×106/ml,實(shí)驗(yàn)中處理組加入10μM Aβ

5、1-42。具體分組:
　　(1)空白組:僅接種MI;
　　(2)Aβ激活組:接種MI+Aβ1-42;
　　(3)共培養(yǎng)組:接種AMSCs+MI+Aβ1-42。
　　96h后觀察細(xì)胞的形態(tài),并用ELISA檢測(cè)各組炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量變化。
　　3.Transwell分層共培養(yǎng)體系的建立:
　　上室Transwell小室接種小膠質(zhì)細(xì)胞,下室6孔塑料培養(yǎng)板培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)中處理組加入

6、10μM Aβ1-42。實(shí)驗(yàn)分組如下:
　　(1)空白對(duì)照組(control組):神經(jīng)元細(xì)胞正常培養(yǎng)于下室,上室加培養(yǎng)基;
　　(2)Aβ刺激組(神經(jīng)元細(xì)胞+Aβ1-42):神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)于下室,上室加入終濃度為10μM Aβ1-42的培養(yǎng)基;
　　(3)MI刺激組(神經(jīng)元細(xì)胞+MI):神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室;
　　(4)Aβ與MI共刺激組(神經(jīng)元細(xì)胞+Aβ1-42+MI):神

7、經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室,上層小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后加入終濃度為10μM Aβ1-42的培養(yǎng)基。
　　(5)AMSCs干預(yù)共培養(yǎng)組(神經(jīng)元細(xì)胞+Aβ1-42+MI+AMSCs):神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室,同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞層加入同等數(shù)量的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞,兩種細(xì)胞貼壁后再加入終濃度為10μMAβ1-42的培養(yǎng)基。
　　4.各組細(xì)胞經(jīng)處理96h之后(4、5組從加入Aβ后計(jì)時(shí)

8、),免疫熒光顯微鏡檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡率:1、用Hoechst33342標(biāo)記法于免疫熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元的凋亡情況;2、AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè):在高倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù),計(jì)算凋亡率=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/總細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的AMSCs接種后貼壁

9、生長(zhǎng),流式細(xì)胞儀鑒定為高表達(dá)CD90、CD105,低表達(dá)CD45、HLA-DR,免疫熒光染色示CD200表達(dá)陽(yáng)性;經(jīng)誘導(dǎo)后的AMSCs表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物MAP-2、GFAP;
　　2.分離培養(yǎng)的MI純化后胞體扁平或卵圓形,突起細(xì)長(zhǎng)。經(jīng)CD68免疫熒光檢測(cè),陽(yáng)性率在92％以上;
　　3.原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞胞體豐滿,突起清晰,神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物MAP-2免疫熒光鑒定可見陽(yáng)性細(xì)胞胞漿及突起均著色,純度可達(dá)到90％;

10、>　　4.ELISA檢測(cè)各組炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量變化:
　　(1)在Aβ的刺激下,MI分泌炎性分子TNF-α、IL-6和NO的量上升(P<0.05);
　　(2)AMSCs共培養(yǎng)組中炎性分子的量與Aβ激活組比較下降(P<0.05),但與空白組比較,即使與AMSCs共培養(yǎng),Aβ仍使TNF-α、IL-6和NO的分泌量升高(P<0.05)。
　　5.AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)

11、顯示:
　　(1)空白對(duì)照組中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率為12.08,單純小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)凋亡率為13.25,差異不明顯(P>0.05);
　　(2)單純Aβ與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)凋亡率為19.75,與空白對(duì)照組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);
　　(3)Aβ與MI共刺激組與Aβ刺激組比較,可見凋亡率升高至31.46,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);
　　(4)加入AMSCs共培養(yǎng)后可使神經(jīng)元細(xì)胞凋

12、亡率降至20.79,雖仍高于空白對(duì)照組(P<0.01),但與Aβ與MI共刺激組比較凋亡率下降(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.AMSCs來源豐富、擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫源性低,具有干細(xì)胞特性,可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞;
　　2.Aβ1-42可激活MI,促使其炎性因子分泌增多,體外培養(yǎng)的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后可使后者致炎因子分泌下調(diào);
　　3.Aβ1-42介導(dǎo)MI的活化對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡作用,AMSCs可