人羊膜間充質(zhì)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)元樣細胞誘導(dǎo)分化及其鈉離子通道電生理特性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 1．分離、培養(yǎng)和鑒定人羊膜間充質(zhì)干細胞，觀察其生物學(xué)特性，探討其應(yīng)用于神經(jīng)再生治療的可行性。
　　 2．通過體外誘導(dǎo)分化實驗，探討人羊膜間充質(zhì)干細胞向視網(wǎng)膜細胞分化的可能性。
　　 3．對人羊膜間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)前后鈉離子通道的電生理特性進行研究，探討其在向視網(wǎng)膜神經(jīng)元樣細胞分化過程中細胞功能的變化情況。
　　 方法：
　　 1．經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，無菌采集健康足月剖腹產(chǎn)胎盤6份。采用

2、機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，PBS沖洗后剪成碎片，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液37℃消化10min，共4次，收集細胞，用DMEM/F12/10%FBS／10ng/mLEGF培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和純化。
　　 2．倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；記錄生長曲線；用流式細胞儀鑒定傳1～3代人羊膜間充質(zhì)干細胞的表面標(biāo)志CD45、CD90(Thy1)和CD49d；免疫熒光細胞化學(xué)法和流式細胞儀檢測神經(jīng)干／祖細胞標(biāo)記蛋白Nestin、Vim

3、entin和Musash-1的表達。
　　 3．用2%DMSO／200μmol/LBHA／10ng/mLbFGF誘導(dǎo)第3代人羊膜間充質(zhì)干細胞，用免疫熒光細胞化學(xué)法和流式細胞儀檢測誘導(dǎo)前后神經(jīng)譜系標(biāo)記蛋白Nestin、MAP2、NSE、GFAP和光感受器細胞標(biāo)記蛋白Rhodopsin的表達；實時熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)0、3和7天Nestin、Rhodopsin和SCN2AmRNA的表達；通過全細胞膜片鉗技術(shù)記錄誘導(dǎo)前后細胞表面鈉離

4、子電流。
　　 結(jié)果：
　　 1．人羊膜間充質(zhì)干細胞為貼壁細胞，表現(xiàn)為成纖維細胞樣，可在體外大量擴增并純化；表型分析結(jié)果顯示：CD90(Thy1)、CD49d陽性表達，CD45陰性表達；人羊膜間充質(zhì)干細胞表達神經(jīng)干／祖細胞的標(biāo)記蛋白，流式細胞儀顯示從傳1代至4代，Nestin陽性和Vimentin陽性細胞百分?jǐn)?shù)均在80-90%，而Musashi-1陽性細胞百分?jǐn)?shù)則維持在95%以上。
　　 2．誘導(dǎo)分化后，大部分細

5、胞變成具有細長突起的神經(jīng)元樣形態(tài)；流式細胞儀檢測顯示：誘導(dǎo)7d后Nestin陽性細胞從81.3%下降至24.9%，而MAP2陽性細胞從15.7%上升至91.3%，Rhodopsin陽性細胞從10.3%上升至97.1%，NSE陽性細胞從20.9%上升至94.3%，GFAP陽性細胞從1.4%上升至18.0%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P＜0.05)；實時熒光定量PCR檢測顯示：誘導(dǎo)3天后，Nestin的mRNA迅速下降為原來的0.19倍，7

6、天后下降為0.15倍；誘導(dǎo)3天后，Rhodopsin的mRNA上升為原來的1.62倍，7天后上升為2.06倍；誘導(dǎo)3天后，SCN2A的mRNA上升為原來的1.24倍，7天后上升為1.83倍；人羊膜間充質(zhì)干細胞在誘導(dǎo)前未記錄到瞬時鈉內(nèi)向電流(0/13)，誘導(dǎo)后部分細胞受去極化刺激時記錄到鈉離子內(nèi)向電流(4/12)，細胞表面鈉離子電流出現(xiàn)率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。
　　 結(jié)論：
　　 1．人羊膜間充質(zhì)干細胞可