β淀粉樣肽刺激小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　 Aβ刺激激活原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，取小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，觀察Aβ刺激激活小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性作用，結(jié)合本課題組之前關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活及TNFa在AD發(fā)病中的作用機(jī)制的研究，觀察TNF-a、IL-Iβ等細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷，探討小膠質(zhì)細(xì)胞源性炎性反應(yīng)在AD發(fā)病中的可能作用途徑和機(jī)制，為阿爾茨海默病(AD)的抗炎治療提供一定的理論依據(jù)，及能夠

2、為AD的預(yù)防和早期治療提供更有力的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 根據(jù)本課題組在先前研究中所檢測(cè)得到Aβ1-42對(duì)體外小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-amRNA表達(dá)及TNF-a蛋白外分泌量的影響，獲得Aβ肽對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的最佳刺激方案，用激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，用western-blot法檢測(cè)刺激后海馬神經(jīng)元內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化碳合酶和硝基酪氨酸的表達(dá)水平，獲得最佳刺激方案，用TUNEL法和DNA Lad

3、der凝膠電泳法觀察海馬神經(jīng)元的凋亡，同時(shí)用激酶活性測(cè)定法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白casepase-3的激活程度。
　　 [結(jié)果]
　　 1.利用“無(wú)血清培養(yǎng)法”進(jìn)行原代海馬神經(jīng)元的細(xì)胞培養(yǎng)及純化，用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光的方法對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，“無(wú)血清培養(yǎng)法”能獲得高純度的海馬神經(jīng)元。
　　 2.用Aβ肽處理小膠質(zhì)細(xì)胞取用藥24 h之上清來(lái)刺激原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)(最佳刺激濃度及時(shí)間來(lái)源于本課題組先前研究結(jié)

4、果)。
　　 3.Western blot法進(jìn)行檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的水平，可觀察到條件培養(yǎng)基刺激海馬神經(jīng)元6 h，INOS及NT即有少量的表達(dá)，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，iNOS和硝基酪氨酸的表達(dá)愈明顯。
　　 4.TUNEL和DNA電泳鑒定神經(jīng)元細(xì)凋亡程度及刺激前后對(duì)照差異，可以觀察到，海馬神經(jīng)元出現(xiàn)了明顯的凋亡，且隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率也在增加。
　　 [結(jié)論]