三氧化二砷對原代培養(yǎng)海馬神經元凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：采用流式細胞術和蛋白印跡法觀察砷對原代培養(yǎng)海馬神經元是否發(fā)生凋亡，及其作用機制。
　　方法：⑴離體培養(yǎng)新生24h內SD乳鼠海馬神經元，每天在倒置相差顯微鏡下進行神經元的形態(tài)學觀察；⑵MTT法檢測培養(yǎng)不同時間段神經元的活力變化，并繪制生長曲線；⑶離體培養(yǎng)新生24h內SD乳鼠海馬神經元，取純化培養(yǎng)9d神經元利用免疫熒光染色法檢測β-tublinШ的表達率；⑷離體培養(yǎng)新生24h內SD乳鼠海馬神經元，取培養(yǎng)2、4、8、12、16、2

2、0、24d海馬神經元，蛋白印跡法檢測MAP-2蛋白的表達變化；⑸以不同濃度三氧化二砷（0、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）染毒24小時，MTT法檢測不同濃度染毒組對神經元活力的影響；⑹流式細胞儀（Annexin V-FITC/PI雙染法）定量分析各實驗組凋亡率；⑺測定各組神經元中超氧化物歧化酶（SOD)、乙酰膽堿酯酶（TChE)活性和丙二醛(MDA)含量；⑻Western blot方法檢測各實

3、驗組內海馬神經元中Bcl-2和Bax蛋白表達的含量。
　　結果：①倒置相差顯微鏡下原代培養(yǎng)的海馬神經元，剛分離種植時可見神經細胞為圓形，6～8 h內多數(shù)細胞開始貼壁，24 h后絕大多數(shù)神經細胞貼壁，3d細胞聚集成團，突起增大、增粗，培養(yǎng)5~7d神經元胞體豐滿，暈光形成，突起增粗、增長交織成的網絡更密集。培養(yǎng)14-16d后，神經元開始退化。以Neurobasal培養(yǎng)基（含2％B27）培養(yǎng)神經元生長好形態(tài)清晰。②原代海馬神經元生長曲線

4、測定顯示，海馬神經元體外培養(yǎng)條件下經歷了生長潛伏期(2~4 d)，對數(shù)生長期(4~8d)，后進入生長平臺期(8~14d)，細胞生長處于停滯狀態(tài)。③經神經元特異性標記物β-tublinШ單克隆抗體和DAPI熒光染色后在熒光倒置顯微鏡下鑒定，計算海馬神經元純度為93.0%±2.5%，能夠滿足下一步的實驗要求。④經蛋白印跡鑒定結果顯示分別在2、4、8、12、16、20、24d中均可發(fā)現(xiàn)MAP-2蛋白。⑤MTT法檢測結果顯示三氧化二砷對神經元細

5、胞有一定的細胞毒性，細胞存活率在24h時間點隨著染毒劑量的逐漸增加而下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01)。⑥流式細胞儀檢測凋亡率顯示，各濃度組處理24h對海馬神經元凋亡率的影響具有顯著差異（P<0.01），各濃度組同對照組比較，凋亡率隨濃度的增加而增加。⑦與對照組比較，各染毒組S0D和TChE活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，具有明顯的劑量效應。⑧Western blot分析顯示同時隨著染毒