鉛及鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)表達(dá)的影響.pdf

1、鉛是人類所認(rèn)識的最古老的毒物之一，也是迄今工作環(huán)境和生活環(huán)境中仍廣泛存在的一種毒物。人群流行病學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)研究都揭示了低水平鉛暴露和持續(xù)神經(jīng)行為損害的關(guān)系。流行病學(xué)研究結(jié)果表明環(huán)境鉛暴露可損害兒童的認(rèn)知、行為和神經(jīng)心理學(xué)功能，而且該暴露停止后仍可持續(xù)存在于環(huán)境中。當(dāng)前研究表明發(fā)育中慢鉛暴露可能干擾了細(xì)胞識別系統(tǒng)所介導(dǎo)的突觸功能的形成和調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能的缺陷和神經(jīng)行為功能的改變。細(xì)胞識別系統(tǒng)包含神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)。NCAM

2、屬于粘附分子免疫球蛋白超家族成員之一，由5個(gè)Ig同源性分子，后跟2個(gè)纖維結(jié)合蛋白Ⅲ型區(qū)域(FnⅢ1，F(xiàn)nⅢ2)組成。根據(jù)NCAM分子量的不同主要分為三種亞型即NCAM120、NCAM140、NCAM180；所有的亞型都是通過位于小鼠9號、大鼠的8號、人11號染色體上單基因編碼轉(zhuǎn)錄物交替剪接所產(chǎn)生的，且該三中亞型具有不同的結(jié)構(gòu)分布和功能。NCAM除了參與同源性(NCAM—NCAM)和異源性(NCAM和一系列蛋白包括成纖維生長因子受體，神經(jīng)

3、細(xì)胞粘附分子L1和不同類型的膠原和蛋白聚糖)細(xì)胞間相互作用外，它也能夠通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯后修飾和細(xì)胞膜表達(dá)水平改變機(jī)制來調(diào)節(jié)活性依賴突觸重排。硒可拮抗鉛的吸收，促進(jìn)海馬組織神經(jīng)元的存活和突起生長，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究擬通過鉛及鉛硒聯(lián)合孵育對海馬神經(jīng)元進(jìn)行染毒處理，在觀察終點(diǎn)分別測定海馬神經(jīng)元存活率、軸突長度、NCAM及NCAMmRNA、STXmRNA和PSTmRNA表達(dá)，探討NCAM及硒在鉛神經(jīng)毒性及其解毒中作用機(jī)制。

4、研究目的: 1.探索鉛孵育對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元NCAM表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制。 2.探索不同作用方式鉛硒聯(lián)合孵育對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元NCAM表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制。 研究方法: 1.應(yīng)用MTT方法檢測鉛及不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率；在熒光相差倒置顯微鏡下拍照并通過Imagepro—plus軟件測定海馬神經(jīng)元軸突長度，以探討單獨(dú)鉛孵育及不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對海馬神經(jīng)元

5、存活、生長和發(fā)育的影響； 2.應(yīng)用westernblot技術(shù)檢測體外培養(yǎng)第四天單獨(dú)鉛孵育組和不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育組海馬神經(jīng)元NCAM表達(dá)水平； 3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，確定培養(yǎng)第四天鉛孵育組和不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育組海馬神經(jīng)元NCAM、STX和PST的轉(zhuǎn)錄水平。 研究結(jié)果: 1.鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率、軸突長度、NCAM蛋白及NCAMmRNA、STXmRNA和PSTmRNA表達(dá)的影

6、響1.1鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率的影響：10-5MPbCl2可引起神經(jīng)元存活率的明顯下降即由71％下降到了37％，與對照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)； 1.2鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突長度的影響：培養(yǎng)第2天鉛處理組神經(jīng)元軸突長度明顯比對照組短，鉛可抑制軸突的向外生長； 1.3鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元NCAM蛋白及NCAMmRNA表達(dá)的影響：單獨(dú)鉛處理可降低海馬神經(jīng)元NCAM蛋白及NCAMmRNA的表達(dá)；

7、 1.4鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元STXmRNA表達(dá)的影響：單獨(dú)鉛處理可降低海馬神經(jīng)元STXmRNA的表達(dá)； 1.5鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元PSTmRNA表達(dá)的影響：單獨(dú)鉛處理可降低海馬神經(jīng)元PSTmRNA的表達(dá)。 2.不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率、軸突長度、NCAM蛋白及NCAMmRNA、STXmRNA和PSTmRNA表達(dá)的影響2.1不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率的影響：在海馬

8、神經(jīng)元培養(yǎng)七天時(shí)間內(nèi)，單獨(dú)硒(10-6M)處理對海馬神經(jīng)元存活率影響不明顯；先鉛后硒孵育組和鉛硒聯(lián)合孵育組均著海馬神經(jīng)元培養(yǎng)時(shí)間的延長其存活率也隨之下降，但在同一處理時(shí)間點(diǎn)與鉛處理組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；而先硒后鉛孵育組海馬神經(jīng)元存活率明顯高于單獨(dú)鉛孵育組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，提示硒可能可預(yù)防鉛所致的神經(jīng)毒性； 2.2不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元軸突長度的影響：鉛組、先鉛后硒組和鉛硒聯(lián)合孵育

9、組之間在軸突長度上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；先硒后鉛組軸突長度明顯長于單獨(dú)鉛孵育組，提示先硒后鉛相對于先鉛后硒和鉛硒聯(lián)合孵育組更有利于海馬神經(jīng)元軸突的向外生長； 2.3不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元NCAM蛋白及NCAMmRNA表達(dá)水平的影響：先鉛后硒、先硒后鉛和鉛硒聯(lián)合孵育組均可增加海馬神經(jīng)元NCAM蛋白及NCAMmRNA的表達(dá)水平； 2.4不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元STXmRN

10、A表達(dá)的影響：先硒后鉛組和鉛硒聯(lián)合孵育組STXmRNA表達(dá)水平高于單獨(dú)鉛處理組，可提高海馬神經(jīng)元STX轉(zhuǎn)錄水平； 2.5不同作用方式的鉛硒聯(lián)合孵育對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元PSTmRNA表達(dá)的影響：先鉛后硒孵育組和鉛硒聯(lián)合孵育組PSTmRNA表達(dá)水平高于單獨(dú)鉛處理組，可提高海馬神經(jīng)元PST轉(zhuǎn)錄水平。 結(jié)論: 1本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)鉛孵育可降低原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元存活率和抑制神經(jīng)元軸突向外生長，揭示鉛對發(fā)育中海馬損傷可能是

11、鉛神經(jīng)毒性的作用位點(diǎn)之一； 2本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低劑量鉛孵育可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元NCAM蛋白、NCAMmRNA、STXmRNA和PSTmRNA的表達(dá)下降，提示鉛可影響NCAM蛋白的表達(dá)和NCAM、STX、PST的轉(zhuǎn)錄水平； 3本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示先硒后鉛孵育可提高海馬神經(jīng)元存活率和促進(jìn)神經(jīng)元軸突向外生長，揭示硒可能對鉛所致的神經(jīng)毒性起到一定的預(yù)防作用； 4本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同作用方式鉛硒聯(lián)合孵育可提高海馬神經(jīng)元NCAM蛋白、NC