PTSD樣大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及LTP、ACP變化的研究.pdf

1、目的: PTSD(創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙)是指由異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙。其特征性的癥狀為病理性重現(xiàn)創(chuàng)傷體驗(yàn)、持續(xù)性警覺(jué)增高、持續(xù)性回避、對(duì)創(chuàng)傷性經(jīng)歷的選擇性遺忘等的臨床精神癥狀，隨著自然災(zāi)害、重大交通事故、戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力和意外事故等的發(fā)生，PTSD發(fā)生率也越來(lái)越高?，F(xiàn)今PTSD以其發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、難以治愈等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響人們身心健康而備受關(guān)注。 海馬是與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，而且在

2、營(yíng)養(yǎng)機(jī)能方面也有重要作用，應(yīng)激選擇性的損害海馬。有報(bào)道，PTSD致海馬縮小，那么海馬體積的縮小，是否由于海馬神經(jīng)元的凋亡，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少所致，同時(shí)海馬體積縮小后其學(xué)習(xí)記憶功能又將發(fā)生什么變化。文獻(xiàn)報(bào)道，ACP(酸性磷酸酶)活性變化推測(cè)可能反應(yīng)海馬神經(jīng)元損傷的程度。LTP(長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng))是目前公認(rèn)理想代表學(xué)習(xí)記憶功能的電生理指標(biāo)，為此，研究PTSD樣大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及LTP、ACP的變化，為進(jìn)一步揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 實(shí)驗(yàn)方法: 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年健康雄性Wistar大鼠300只，體重220～250g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，隨機(jī)分為五大組，每組60只，分別平均用于AnnexinV-F1TC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡、ACP組織化學(xué)技術(shù)，ACP酶電鏡、LTP。每組又分為SPS模型建立后的6h、12h、1d、7d、14d組及正常組，每組10只。 2、PTSD樣大鼠模型的建立 采用2

4、005年日本文部省召開(kāi)的國(guó)際PTSD科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議確定的關(guān)于PTSD樣大鼠模型-SPS刺激后無(wú)干擾喂養(yǎng)的方法，SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理：禁錮2h；強(qiáng)迫性游水20min(水深40cm，水溫25℃)；休息15分鐘后乙醚麻醉至意識(shí)喪失。 3、海馬神經(jīng)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 分別取正常及經(jīng)過(guò)SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各組大鼠依次麻醉后開(kāi)顱取出海馬，制成單細(xì)胞懸液，加入FITC和PI，上機(jī)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、分析。 4、海馬神經(jīng)細(xì)胞的透射電鏡制樣 分別取正常及經(jīng)過(guò)SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各組大鼠依次麻醉后灌流固定，取大鼠海馬組織，常規(guī)透射電鏡制樣，倒扣包埋海馬CA3區(qū)、聚合，半薄切片定位，超薄切片，透射電鏡(JEOL 1200EX)80KVT下觀察。 5、ACP酶組織化學(xué)技術(shù)與圖象分析 分別取正常及經(jīng)過(guò)SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各組大鼠依次麻醉灌流固定取腦，續(xù)固定后浸于H

6、olt'S液至沉下。制成14μm厚冰凍切片，Gomori'S法配制孵育液，室溫孵育切片90分鐘，后光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，BX60，Japan)下觀察、攝片，并做圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 6、ACP酶電鏡細(xì)胞化學(xué) 分別取正常及經(jīng)過(guò)SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各組大鼠依次麻醉灌流固定取腦，續(xù)固定后浸于Holt'S液至沉下。制成40μm厚非冰凍切片，Gomori'S法配制ACP酶孵育液，37℃孵育切片30分

7、鐘，常規(guī)透射電鏡制樣，定位海馬CA3區(qū)倒扣包埋、聚合，半薄切片再定位，AO超薄切片機(jī)切片，透射電鏡(JEOL 1200EX)80KV下觀察拍照。 7、電生理檢測(cè) 分別取正常及經(jīng)過(guò)SPS刺激后6h、12h、1d、7d、14d各組大鼠依次麻醉手術(shù)開(kāi)顱植入電極，進(jìn)行電生理記錄，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果: 1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 SPS后6h組與對(duì)照組相比，凋亡率升高，SPS后12h凋亡率升高，SPS后1d

8、組凋亡率進(jìn)一步升高，SPS后7d組與SPS后1d組相比，凋亡率下降，SPS后14d組凋亡率進(jìn)一步降低。 2、透射電鏡結(jié)果 SPS后12h組的部分海馬神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，染色質(zhì)邊集并漸出現(xiàn)新月?tīng)罡淖?。SPS后1d組部分神經(jīng)元形成新月形小體，細(xì)胞核膜出現(xiàn)明顯的皺折，細(xì)胞核開(kāi)始裂解。 3、ACP酶組織化學(xué)技術(shù)結(jié)果 低倍鏡下整個(gè)海馬呈現(xiàn)ACP陽(yáng)性反應(yīng)，以CA3區(qū)反應(yīng)最為明顯，高倍鏡下ACP的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色的硫

9、化鉛顆粒產(chǎn)物均勻分布在細(xì)胞質(zhì)核周部，延伸到突起：SPS后6h組與對(duì)照組相比，ACP的陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，SPS后12h陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，SPS后1d組ACP的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，SPS后7d組與SPS后1d組相比，陽(yáng)性表達(dá)下降，SPS后14d組陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步降低。 4、ACP酶電鏡細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 電鏡下，在正常對(duì)照組神經(jīng)元，胞質(zhì)內(nèi)ACP酶陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為高電子密度的黑色磷酸鉛沉淀可見(jiàn)圓形溶酶體(SLY)、高爾基復(fù)合體的板層中均有分布，

10、PTSD后6h組吞噬增強(qiáng)，溶酶體有則由圓形變?yōu)榫€條狀(NLT)；PTSD后1d組吞噬最強(qiáng)，可見(jiàn)線條狀溶酶體(NLY)；PTSD后7d組可見(jiàn)線狀和各種形狀的溶酶體在胞質(zhì)中的分布。 5、電生理結(jié)果 高頻刺激(HFS)后，SPS后6h組平均幅值增強(qiáng)率與對(duì)照組比較逐漸減小，SPS后12h組更為減小，SPS后1d組時(shí)降至最低，SPS后7d組開(kāi)始回升，SPS后14d組進(jìn)一步回升。 6、圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 經(jīng)SPS刺

11、激后，海馬神經(jīng)元凋亡率SPS后6h組較對(duì)照組升高，SPS后12h組進(jìn)一步升高，SPS后1d組升至最高，SPS后7d組凋亡率開(kāi)始下降，SPS后14d組凋亡率進(jìn)一步降低；經(jīng)SPS刺激后，海馬神經(jīng)元ACP酶陽(yáng)性表達(dá)SPS后6h組較對(duì)照組增強(qiáng)，SPS后12h組進(jìn)一步增強(qiáng)，SPS后1d組升至最高，SPS后7d組陽(yáng)性表達(dá)降低，SPS后14d組陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步降低；經(jīng)SPS刺激后，海馬神經(jīng)元電生理結(jié)果，HFS后，SPS后6h組平均幅值增強(qiáng)率與對(duì)照組比較