創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬神經元凋亡相關基因及線粒體通路機制的研究.pdf

1、前言
　　 創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是由于異常威脅性或災難性心理創(chuàng)傷導致出現(xiàn)長期持續(xù)性精神障礙,其臨床表現(xiàn)以再度體驗創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為。簡而言之,PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[1,2]。近年來,隨著戰(zhàn)爭、社會暴力事件、重大交通事故和自然災害等創(chuàng)傷意外的不斷增多,PTSD已經成為一種普遍的精神障礙而被關注[3]。目前,PTSD及其神經生物學致病

2、機制的探討已成為涉及創(chuàng)傷學、神經精神病學、心理學等跨學科研究的重點。
　　 下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸系統(tǒng)在應激反應調控中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),PTSD不同于一般的應激反應及其它精神疾病,PTSD患者血液中的皮質酮基礎水平往往較低,存在HPA軸的紊亂[4]。糖皮質激素(GC)是腎上腺皮質分泌的重要應激激素。GC受體有糖皮質激素受體(glucocorticoidr

3、eceptor,GR)和鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)。海馬是學習記憶的重要腦區(qū),也是腦部GR含量最高的區(qū)域,因此在應激過程中海馬是糖皮質激素攻擊的主要靶區(qū)[5]。近年來,對遭受戰(zhàn)爭和暴力之后的PTSD患者進行磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)檢查,發(fā)現(xiàn)有海馬萎縮的現(xiàn)象[6]。PTSD患者海馬的形態(tài)結構在應激反應中發(fā)生了明顯的變化,主要表現(xiàn)為體積變小[

4、7],但其發(fā)生機制目前尚不明確。
　　 細胞凋亡是由基因控制的細胞主動性死亡過程,是機體生長發(fā)育、細胞分化、生理及病理性死亡的重要機制。細胞凋亡的調控,主要有三條誘導途徑:外源性途徑,即死亡受體途徑；內源性途徑,即線粒體途徑；此外還有內質網途徑[8,9]。不同的死亡信號通過不同的途徑誘導細胞凋亡。長期以來,線粒體一直被公認為細胞內的能量加工廠,其主要作用是為細胞的各種生命活動提供所需的能量。但越來越多的研究表明,在細胞凋亡過程中

5、,許多重要事件的發(fā)生都與線粒體密切相關,如線粒體膜電位的喪失、細胞色素C(Cytochrome C,CytC)的釋放、Bcl-2家族促進和抑制凋亡蛋白的參與等等[10]。線粒體是細胞內死亡信號的重要感受器與放大器。在細胞凋亡早期,核染色體DNA還未改變之前,已出現(xiàn)線粒體結構和功能的變化,說明線粒體在細胞凋亡調控過程中起重要作用[11]。凋亡信號經線粒體放大,線粒體再釋放CytC、Smac/DIABLO和絲氨酸蛋白Omi/HtrA2,激活

6、Caspase級聯(lián)反應,最終引起凋亡,這是Caspase依賴的信號傳導通路。線粒體也可釋放凋亡誘導因子(apoptosis induce factor,AIF)、核酸內切酶G直接引起凋亡,這是Caspase非依賴的信號傳導途徑[12]。
　　 線粒體在細胞凋亡機制中的作用越來越受到人們的關注。于是,有人提出GC受體可以與線粒體作用而誘導細胞凋亡的假說[13]:第一,非基因組的作用。應激活化的大量GR可以直接與線粒體膜結合而改變線

7、粒體膜電位。第二,基因組的作用。GC可以與其他的一些分子如熱休克蛋白等相互作用,從而易位入細胞核,與DNA結合并影響轉錄活動。Bax作為GR活化的下游調制器之一,可以被上調并易位入線粒體與凋亡調制器MAP-1結合。這兩種方式均可以導致線粒體膜電位改變。線粒體膜電位下降,即可引起線粒體膜間隙的CytC釋放至胞質。釋放入胞質的CytC在ATP或dATP的輔助下可特異地與凋亡蛋白酶激活因子(Apoptoticprotease activati

8、ng factors,Apaf-1)結合成復合體,啟動Caspase-9形成全酶,導致Caspase-9活化。后者繼續(xù)激活其下游分子,包括Caspase-3等,從而誘導細胞凋亡[14]。
　　 在我國,由于地震、洪水等自然災害時有發(fā)生,災后一些人會出現(xiàn)長期焦慮與激動情緒。同時隨著社會的發(fā)展、生活的節(jié)奏加快,來自社會、家庭、工作的壓力不斷增大,這些均成為PTSD誘發(fā)因素。因而如何治療這些因災難、壓力而引起的精神疾病是一個刻不容緩的

9、課題。以往由于缺乏理想的動物模型,使PTSD的基礎研究受到了很大限制。SPS模型作為PTSD動物模型的確認,為深入研究應激障礙的發(fā)病機理提供了行之有效的方法。目前,關于PTSD細胞凋亡的研究國內外尚未見報道。因此,本課題引用國際上最新的SPS做為PTSD動物模型來進行PTSD的基礎研究,首次揭示PTSD海馬細胞凋亡、凋亡相關基因及線粒體通路的調控機制,從而為這一疾病的預防、診斷和治療尋找一條有效的途徑。
　　 實驗方法
　

10、　 采用國際認定的無連續(xù)單一應激(Single-Prolonged Stress,SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型。應用原位末端標記法(TUNEL染色法)檢測PTSD大鼠海馬細胞凋亡的規(guī)律；應用透射電子顯微鏡術觀察PTSD大鼠海馬凋亡細胞形態(tài)學變化；應用體視學方法測定PTSD大鼠海馬體積的變化；應用免疫組織化學技術、免疫熒光技術及免疫印跡技術檢測PTSD大鼠海馬神經元凋亡相關因子Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9

11、和Caspase-3蛋白含量的變化；應用RT-PCR技術檢測凋亡相關基因Bcl-2和Bax mRNA含量的變化；應用免疫雙標、激光共聚焦掃描顯微鏡技術觀察PTSD大鼠海馬Bcl-2和Bax以及Caspase-9和Caspase-3的表達與共存；應用酶電鏡細胞化學技術觀察PTSD大鼠海馬線粒體細胞色素C的表達與釋放。
　　 結論
　　 1、PTSD大鼠出現(xiàn)了海馬萎縮現(xiàn)象,神經元凋亡可能是導致PTSD大鼠海馬發(fā)生萎縮的因為之

12、一。
　　 2、凋亡相關基因Bcl-2和Bax含量增加以及兩者比值的失衡可能是導致PTSD大鼠海馬神經元發(fā)生凋亡的重要機制。
　　 3、在PTSD大鼠海馬神經元中,線粒體腫脹、外膜破裂,大量CytC釋放入胞質。
　　 4、CytC從線粒體釋放入胞質是引發(fā)PTSD大鼠海馬神經元凋亡的關鍵步驟。
　　 5、Caspase-9和Caspase-3在PTSD大鼠海馬神經元凋亡的調控中均發(fā)揮了重要作用,線粒體通路的