創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠藍(lán)斑核受體—GR，MR的表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是對刺激因素的一種異常精神反應(yīng)。盡管進(jìn)行了大量的神經(jīng)生物學(xué)研究,但目前對PTSD的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚。PTSD臨床表現(xiàn)多樣,主要包括創(chuàng)傷經(jīng)歷再體驗(yàn)、情感麻木與回避行為、警覺增高所致易激惹癥狀三大癥候群。這些癥狀表明PTSD患者可能存在血中皮質(zhì)醇水平增高的現(xiàn)象。然而,大量研究表明PTSD患者血中皮質(zhì)醇水平比正常人低。目前,在其他

2、抑郁癥的患者中主要存在皮質(zhì)醇負(fù)反饋的抑制,PTSD患者卻有負(fù)反饋增強(qiáng)的現(xiàn)象。目前報(bào)道PTSD患者尿中去甲腎上腺素和腎上腺素的排泄量明顯增加。藍(lán)斑是去甲腎上腺素的主要集中地,另外,藍(lán)斑還參與睡眠障礙,警覺過度,易激惹等PTSD臨床癥狀。
　　 皮質(zhì)類固醇受體包括糖皮質(zhì)激素受體(GR,Ⅰ型),和鹽皮質(zhì)激素受體(MR,Ⅱ型)。MR.是高親和力和低容量的糖皮質(zhì)激素受體系統(tǒng),而GR和高容量的糖皮質(zhì)激素受體系統(tǒng)。GR在應(yīng)激后糖皮質(zhì)激素的生理

3、上升期不斷被占領(lǐng)結(jié)合。兩種受體的平衡對應(yīng)激反應(yīng)和行為學(xué)適應(yīng)發(fā)揮重要的作用。糖皮質(zhì)激素通過GR,MR介導(dǎo)的兩種反饋模式使HPA軸處于適當(dāng)?shù)乃?。在這個過程中,可以認(rèn)為皮質(zhì)醇受體起到了一種轉(zhuǎn)錄因子的功能。受體數(shù)量,親和力以及在應(yīng)激反應(yīng)中的功能不同,導(dǎo)致不同個體血中皮質(zhì)醇激素水平的不同,產(chǎn)生不同的生物學(xué)行為。目前對PTSD的病人和相關(guān)動物模型都觀察到了GR,MR的改變。
　　 細(xì)胞凋亡(apoptosis),又稱程序性細(xì)胞死亡(pro

4、grammed cell death,),是由一系列生理和病理刺激引起的。在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中,主要是細(xì)胞色素C從線粒體膜上釋放到了胞漿中,導(dǎo)致Caspases級聯(lián)放大信號系統(tǒng)的激活。細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿中,首先活化Caspase-9,Caspase-9再酶解Caspase-3前體,從而活化Caspase-3,最終引起染色體DNA的降解和細(xì)胞的解體。目前已經(jīng)報(bào)道PTSD患者海馬體積減小,以及單一連續(xù)應(yīng)激(single prolonge

5、d stress,SPS)導(dǎo)致杏仁核神經(jīng)元的凋亡。Bracha HS對發(fā)生PTSD的退伍軍人的尸體解剖中發(fā)現(xiàn),藍(lán)斑神經(jīng)元數(shù)目減少,但藍(lán)斑神經(jīng)元數(shù)目減少是否由凋亡引起的呢?PTSD患者藍(lán)斑神經(jīng)元是否存在凋亡,是否導(dǎo)致了藍(lán)斑功能的異常。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、模型制作及分組
　　 采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學(xué)會議確定的關(guān)于大鼠PTSD模型-SPS。其具體方法是將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理:禁錮2

6、h；強(qiáng)迫性游泳20min(水深40cm,水溫25℃)；休息15min后乙醚麻醉,意識喪失后停止麻醉；無干擾常規(guī)喂養(yǎng)直至取材。隨機(jī)分為6組,對照組、SPS后無干擾地靜養(yǎng)1d、4d、7d、14d和28d組。
　　 2、藍(lán)斑GR,MR,Caspase-3免疫組織化學(xué)方法
　　 分別選取各組大鼠依次灌流固定、石蠟包埋小腦,制作石蠟切片,分別用SABC法進(jìn)行藍(lán)斑核的GR,MR,Caspase-3免疫組織化學(xué)染色,DAB顯色,中性樹

7、膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察,攝片。
　　 3、藍(lán)斑Caspase-9免疫熒光染色方法
　　 石蠟切片用PBS漂洗10min×3,5％BSA封閉20min后,滴加鼠單克隆抗體Caspase-9,0.01mol/L PBS代替-抗作陰性對照,4℃孵育過夜,滴加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG濕盒中37℃孵育30min,甘油封片,熒光顯微鏡觀察并攝片。
　　 4、Western blotting檢測藍(lán)斑GR,MR
　　

8、分別取新鮮藍(lán)斑核經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加-抗4℃過夜；HRP標(biāo)記lgG孵育2h,EcL發(fā)光,檢測條帶光密度值。
　　 5、透射電鏡技術(shù)觀察藍(lán)斑神經(jīng)元線粒體COX的表達(dá)變化
　　 切片孵育后用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗,1％OsO44℃固定30-60 min,常規(guī)脫水,包埋,經(jīng)半薄切片、超薄切片厚70μm,JEM1200EX透射電鏡下觀察。
　　 6、RT-PCR檢測藍(lán)斑G

9、R,MR,Caspase-3,Caspase-9和COX斷頭取腦分離藍(lán)斑核,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳,成像并進(jìn)行積分光密度分析。
　　 結(jié) 果
　　 1、藍(lán)斑GR,MR,Caspase-3免疫組織化學(xué)方法染色的結(jié)果
　　 GR分布于神經(jīng)元的胞核,SPS-1d組、SPS-4d組和SPS-7d組與對照組相比,GR的陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng),SPS-14d組與SPS-28d組GR的陽性表達(dá)下

10、降。MR分布于神經(jīng)元的胞體,SPS-1d組與對照組相比,MR的陽性表達(dá)明顯降低,SPS-4d組、SPS-7d組、SPS-14d組與SPS-28d組MR的陽性表達(dá)逐漸增高。
　　 Caspase-3分布于神經(jīng)元的胞體,SPS-1d組、SPS-4d組和SPS-7d組與對照組相比,Caspases-3的陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)；SPS-14d組Caspase-3的陽性表達(dá)下降。
　　 2、藍(lán)斑Caspase-9免疫熒光染色方法結(jié)果

11、r>　　 SPS-1d組、SPS-4d組、SPS-7d組和SPS-14d組Caspase-9陽性反應(yīng)細(xì)胞呈綠色熒光,胞體,胞膜和突起均有著色。
　　 3、Western blotting檢測藍(lán)斑GR和MR的結(jié)果GR的分子量87kb,結(jié)果顯示SPS后1d、4d、7d大鼠藍(lán)斑GR的表達(dá)逐漸上調(diào),14d、28d的GR表達(dá)恢復(fù)性下調(diào)。
　　 MR的分子量分別為112kb,結(jié)果顯示SPS后1d大鼠藍(lán)斑M(jìn)R急劇下降,SPS-4d、

12、SPS-7d、SPS-14d和SPS-28d的MR表達(dá)恢復(fù)性上調(diào)。
　　 4、透射電鏡技術(shù)觀察藍(lán)斑核神經(jīng)元線粒體COX的表達(dá)變化的結(jié)果
　　 對照組藍(lán)斑神經(jīng)元線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)保持良好,陽性產(chǎn)物主要分布在線粒體膜上。SPS刺激后可見線粒體腫脹,空泡變形,嵴斷裂,外膜破裂,COX從線粒體內(nèi)外膜釋放到細(xì)胞漿中。
　　 5、RT-PCR檢測藍(lán)斑GR,MR,Caspase-3,Caspase-9和COX的
　　 結(jié)果

13、
　　 GR在藍(lán)斑內(nèi)表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參照,對各組條帶進(jìn)行分析。與正常對照組相比,SPS后1d、4d、7d大鼠藍(lán)斑GR的表達(dá)逐漸上調(diào),14d、28d表達(dá)恢復(fù)性下調(diào)。
　　 MR在藍(lán)斑內(nèi)表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參照,對各組條帶進(jìn)行分析。與正常對照組相比,SPS后1d藍(lán)斑M(jìn)R急劇下降,SPS-4d、SPS-7d、SPS-14d和SPS-28d組MR表達(dá)恢復(fù)性上調(diào)。
　　 與正常對照組相比,SPS后1d、

14、4d、7d大鼠藍(lán)斑Caspase-3的表達(dá)逐漸上調(diào),14d恢復(fù)性下調(diào)。COX和Caspase-9于SPS-4d達(dá)到頂峰,SPS-7d組和SPS-14d組表達(dá)逐漸下降。
　　 結(jié)論
　　 1、SPS處理后,藍(lán)斑GR出現(xiàn)短暫上調(diào),隨后下調(diào),揭示PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元核受體GR的表達(dá)變化可能導(dǎo)致了PTSD的臨床癥狀。
　　 2、PTSD樣大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元MR的表達(dá)變化可能直接參與了PTSD持續(xù)性精神行為障礙的發(fā)生發(fā)展過程