創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠杏仁核細(xì)胞周期因子表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的:
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)是最為典型的一種應(yīng)激性疾病，是由經(jīng)歷嚴(yán)重的心理創(chuàng)傷事件而導(dǎo)致出現(xiàn)的精神障礙并持續(xù)存在[1]。PTSD的主要臨床表現(xiàn)為:創(chuàng)傷事件的重復(fù)出現(xiàn)，記憶出現(xiàn)異常;持續(xù)性對回憶逃避并反應(yīng)麻木;情緒的易激惹及警覺性增高。目前PTSD的發(fā)病機(jī)制尚未完全搞清，所以尚缺乏有效的治療手段，特別是缺乏直接針對病因靶點(diǎn)的藥物，臨床上以給予患者對癥、心理治療為

2、主，治療效果往往不明確。因此，對PTSD發(fā)病機(jī)制的研究成為了目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　邊緣系統(tǒng)作為主管人體情緒行為反應(yīng)的重要結(jié)構(gòu)，其作用與應(yīng)激反應(yīng)密不可分。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)中極其重要的組成部分，被認(rèn)為是恐懼形成和表達(dá)的關(guān)鍵中樞，與PTSD的發(fā)病關(guān)系密切[2，3]。有研究表明[4]，杏仁核在PTSD中表現(xiàn)為高度敏感，并且它的激活程度和PTSD的癥狀嚴(yán)重程度以及表現(xiàn)的焦慮感是呈正比的。有研究證實(shí)[5]，杏仁核神經(jīng)細(xì)胞在PTSD發(fā)病

3、過程中存在數(shù)量及結(jié)構(gòu)的改變。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在單一連續(xù)刺激(single-prolonged stress，SPS)建立的PTSD大鼠模型的杏仁核腦區(qū)出現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的改變，并且凋亡加速[6，7]。但是，對于其潛在機(jī)制還不十分明確，因此探索PTSD引起杏仁核神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變的機(jī)制對于研究PTSD的發(fā)病機(jī)制及其臨床治療起到關(guān)鍵的作用。
　　細(xì)胞周期是指真核細(xì)胞通過有絲分裂進(jìn)行細(xì)胞增殖的循環(huán)過程，分為4期:DNA合成前期

4、（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期）。影響細(xì)胞周期進(jìn)程的主要調(diào)節(jié)因子有細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶(CDKs)和細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑(CDKIs)，其中Cyclins是調(diào)節(jié)分子，而CDKs是催化亞基[8]。
　　成熟的神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)上皮干細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分化后形成的終末細(xì)胞，已喪失分裂增殖能力。然而，大量研究證據(jù)顯示[9，10]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，神

5、經(jīng)細(xì)胞保留了細(xì)胞周期再次被激活的能力，引起了細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinD1和CDK4的上調(diào)，從而啟動神經(jīng)細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期。但是神經(jīng)細(xì)胞這種重新啟動的細(xì)胞周期過程是紊亂的，這種紊亂的細(xì)胞周期進(jìn)程不能調(diào)控細(xì)胞完成完整的分裂增殖，而是使細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的某個時期，從而引發(fā)細(xì)胞的凋亡或退變[11，12]。
　　細(xì)胞周期影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程的分子機(jī)制目前還不十分清楚。一些相關(guān)的細(xì)胞周期路徑已被證實(shí)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程

6、有關(guān)。綜上，我們推測PTSD條件下，細(xì)胞周期可能參與了杏仁核神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程，引起杏仁核神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變[13]。
　　本研究將細(xì)胞周期調(diào)控作為研究的一個切入點(diǎn)，通過觀察PTSD大鼠杏仁核細(xì)胞周期因子CyclinD1和CDK4基因表達(dá)變化，檢測pRB、E2F1蛋白及RBmRNA、E2FlmRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而探討了PTSD杏仁核神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)變化以及CDK4-pRB-E2F1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，為深入

7、揭示PTSD發(fā)病機(jī)制及有效預(yù)防、治療PTSD提供了可靠的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　本研究采用目前國際上已認(rèn)定的單一連續(xù)刺激(single—Prolonged Stress，SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型，隨機(jī)分為5組，即對照組、SPS刺激后1d、4d、7d和14d組;應(yīng)用曠場(open-field，OF)實(shí)驗(yàn)及恐懼記憶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測定;應(yīng)用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;應(yīng)用免

8、疫熒光技術(shù)檢測PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核及細(xì)胞周期相關(guān)因子CDK4表達(dá)的變化;應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinD1、CDK4、pRB及E2F1蛋白含量的變化;應(yīng)用Real Time PCR方法檢測CyclinD1mRNA、CDK4mRNA、RB mRNA和E2F1mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、PTSD大鼠一般情況的變化:SPS刺激后，PTSD大鼠出現(xiàn)飲食減少，精神萎

9、靡，活動減少，體重下降等現(xiàn)象，同時SPS刺激后大鼠還出現(xiàn)易激惹、好廝打等行為表現(xiàn)。
　　2、PTSD大鼠行為學(xué)改變:曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPS刺激后大鼠進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)顯著低于對照組。同時，SPS刺激后大鼠僵立行為百分比明顯高于對照組。
　　3、PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變:透射電境下見SPS刺激后，杏仁核神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮聚集位于核周邊。隨著SPS刺激時間的遞增，可以觀察到細(xì)胞核膜出現(xiàn)破壞，尤以S

10、PS7d明顯。
　　4、PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核的變化:采用DAPI熒光標(biāo)記杏仁核神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光，經(jīng)過SPS刺激后，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮和核固縮引起細(xì)胞核變小和染色增強(qiáng)，強(qiáng)度于SPS7d達(dá)高峰。
　　5、PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞周期因子CyclinD1、CDK4的表達(dá)變化:(1)Western blotting檢測SPS組大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞CyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)明顯升高并呈逐漸增強(qiáng)趨勢，于7

11、d達(dá)到高峰，明顯高于對照組。(2)Real Time PCR檢測SPS刺激后大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞CyclinD1mRNA、CDK4mRNA的表達(dá)較對照組增多，并隨著刺激后時間的延長呈遞增趨勢，于7d達(dá)到高峰，14d仍維持在較高水平。(3)采用Cy3熒光標(biāo)記杏仁核神經(jīng)細(xì)胞CDK4，CDK4陽性細(xì)胞呈紅色熒光。SPS刺激后，CDK4陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)。在SPS7d、14d組CDK4表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組，并于SPS7d達(dá)到了高峰。
　　6

12、、PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞RB、pRB、E2F1的表達(dá)變化:(1)Western blotting檢測SPS刺激后大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞pRB、E2F1蛋白表達(dá)與對照組相比逐漸升高，于7d時達(dá)到高峰，14d時仍維持較高狀態(tài)。(2)Real Time PCR檢測SPS組大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞RBmRNA、E2F1mRNA的表達(dá)隨刺激后時間呈現(xiàn)上升趨勢，明顯高于對照組。
　　結(jié)論:
　　1、PTSD-SPS大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)及