鉛暴露引起的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞應(yīng)激損傷反應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、目的：重金屬鉛是一種普遍存在的環(huán)境神經(jīng)毒物,低濃度的慢性鉛暴露對嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損害以及對學(xué)習(xí)記憶能力的影響是一個備受關(guān)注的重大問題。嬰幼兒的消化道對鉛的吸收率較成人約高5倍,而排泄率較成人低,加之兒童血腦屏障發(fā)育不全,因此鉛極易在神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生蓄積。0～6歲兒童的大腦智力發(fā)育對鉛的敏感性高于成30倍,我國很多城市兒童鉛中毒已達(dá)到30～40％,是美國兒童的10余倍。研究表明當(dāng)兒童的血鉛由0.48μmol/L升高到0.97μmol

2、/L時,智商平均下降2～6分。
　　 海馬是大腦學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位。海馬長時程增強(qiáng)(Long TermPotentiation,LTP)由于本身具有協(xié)同性、聯(lián)合性、特異性等特點(diǎn),使它成為信息儲存和記憶的細(xì)胞機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),缺氧、低糖、重金屬等應(yīng)激信號可以使海馬神經(jīng)元細(xì)胞受到損傷。當(dāng)應(yīng)激強(qiáng)度過大,海馬神經(jīng)元細(xì)胞功能嚴(yán)重受損時細(xì)胞將啟動生長抑制DNA損傷誘導(dǎo)因子(growth arrest and DNA damageinduci

3、ble gene,GADD153)等信號觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　 大量的動物實(shí)驗研究表明,海馬是鉛損害大腦的主要作用靶點(diǎn)之一。細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)是細(xì)胞生長階段的一個重要環(huán)節(jié)。許多細(xì)胞毒性和遺傳毒性因子可阻斷細(xì)胞周期并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明,鉛是一種細(xì)胞毒性因子可引起不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
　　 本實(shí)驗預(yù)在體外原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中證明鉛可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及功能的損傷;探討鉛對海馬神經(jīng)元細(xì)胞DNA的損傷及其對細(xì)胞周

4、期的阻斷程度;以及鉛誘導(dǎo)cyclin D1的表達(dá)是通過何種信號途徑進(jìn)行的以及這些信號途徑中的某些信號分子的改變,從而進(jìn)一步探討鉛中毒時海馬神經(jīng)元細(xì)胞的變化對學(xué)習(xí)記憶損傷的影響機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、Wistar大鼠腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng),分別加入醋酸鉛培養(yǎng)不同時間及不同濃度,加入醋酸鈉作為對照。
　　 2、流式細(xì)胞技術(shù)分析醋酸鉛對海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。
　　 3、MTT比色法觀察

5、醋酸鉛對海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響。
　　 4、通過SOD、GSH-Px、CAT、TChE及MDA試劑盒檢測鉛對海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響。
　　 5、Western blot方法檢測醋酸鉛誘導(dǎo)的CyclinD1和GADD153蛋白表達(dá)變化。
　　 6、彗星實(shí)驗檢測大鼠海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷程度。
　　 7、倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 8、RT-PCR檢測GADD153的mRN

6、A表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT比色法結(jié)果顯示:細(xì)胞經(jīng)染鉛處理后細(xì)胞增殖比明顯降低,且與鉛的水平呈時間依賴關(guān)系,10μM/L醋酸鉛處理細(xì)胞4天起,細(xì)胞增殖比下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示:隨著染鉛濃度的增加,可觀察到有細(xì)胞阻斷情況發(fā)生。在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞S相過程中尤為顯著。如下圖所示,當(dāng)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞染鉛濃度為0.2μmol/L時,細(xì)胞周期阻斷情況不顯

7、著(sub-G1,S,G0/G1,and G2/M),當(dāng)染鉛濃度增加到1.0μmol/L和and10μmol/L時,S和sub-G1期細(xì)胞周期阻斷情況顯著。
　　 3、Western blot結(jié)果顯示:
　　 (1)隨著染鉛濃度0.2,1.0和10μmol/L的增加,CyclinD1蛋白表達(dá)與對照組相比逐漸降低。從染鉛0.2μmol/L開始,CyclinD1蛋白表達(dá)下降有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),染鉛1.0和10μmo

8、l/L時,CyclinD1蛋白表達(dá)下降有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 (2)用Western blot方法檢測不同濃度染鉛組GADD153蛋白表達(dá)值:醋酸鉛終濃度分別為0.2、1.0、10μM/L。結(jié)果顯示只有10μM/L醋酸鉛誘導(dǎo)的GADD153蛋白表達(dá)增加具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)10μM/L醋酸鉛呈時間依賴性刺激海馬神經(jīng)元細(xì)胞GADD153蛋白表達(dá)增加。醋酸鉛作用24 h后GADD15

9、3蛋白表達(dá)已經(jīng)開始升高,染鉛8天時達(dá)峰值。
　　 4、彗星實(shí)驗結(jié)果顯示:醋酸鉛組中的DNA的尾距(OTM)和彗尾值(％tail)相比對照組,醋酸鉛1.0和10μmol/K組明顯高(P＜0.05)。醋酸鉛0.2μmol/L組的彗尾高于對照組,差異無顯著性意義(P＞0.05)。
　　 5、石墨爐原子吸收法結(jié)果顯示:
　　 (1)醋酸鈉對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞GADD153純化產(chǎn)物中鉛含量無明顯改變;
　　 (2)

10、與對照組相比,10μM/L醋酸鉛處理的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的GADD153純化產(chǎn)物中鉛含量的改變趨勢與GADD153蛋白表達(dá)的改變趨勢相同。醋酸鉛作用12 h時純化產(chǎn)物中鉛含量已經(jīng)開始升高,染鉛8天時達(dá)峰值。
　　 6、原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的過氧化損傷檢測結(jié)果顯示:
　　 (1)染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞SOD活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細(xì)胞12h后,各染毒組與對照組比較SOD活性分別下降35.6％、47.8

11、％、52.2％和56.7％,組間比較差異不顯著(P＞0.05);
　　 (2)染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞GSH-Px活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細(xì)胞12h后,各染毒組與對照組比較,GSH-Px活性均顯著降低(P＜0.05),與對照組比較,從低劑量到高劑量,各染毒組GSH-Px活性分別下降17.6％、25.5％、37.8％和46.2％,組問差異顯著(P＜0.05);
　　 (3)染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞CAT活力檢

12、測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細(xì)胞12h后,各染毒組與對照組比較,CAT活性含量則顯著升高(P＜0.05)。與對照組比較,從低劑量到高劑量,各染毒組CAT活性分別升高27.8％、63.8％、112.5％和117.8％,當(dāng)鉛作用濃度在200μmol/L以下時,組間差異顯著(P＜0.05),而在200μmol/L以上時組間表現(xiàn)差異不顯著(P＞0.05);
　　 (4)染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞TChE活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋

13、酸鉛作用海馬神經(jīng)元細(xì)胞12h后,各染毒組與對照組比較,TChE活性分別下降22.5％、37.4％、42.9％和53.7％,組間比較有顯著差異(P＜0.05);
　　 (5)染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞MDA活力檢測結(jié)果顯示出不同濃度醋酸鉛作用海馬神經(jīng)元細(xì)胞12h后,各染毒組與對照組比較,MDA含量則顯著升高。與對照組比較,從低劑量到高劑量,MDA含量分別升高了54.9％、117.2％、322.5％和342.7％(P＜0.05或P＞0.0

14、5)。
　　 7、RT-PCR檢測GADD153的mRNA表達(dá)結(jié)果顯示:與對照組相比,10μM/L醋酸鉛呈時間依賴性刺激海馬神經(jīng)元細(xì)胞GADD153 mRNA表達(dá)增加。醋酸鉛作用12 h時GADD153 mRNA表達(dá)已經(jīng)開始升高(為對照的1.58倍),染鉛24h時達(dá)峰值(為對照組的2.16倍)。
　　 結(jié)論：
　　 1、染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞SOD活性下降,染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞GSH-Px活性顯著降低,染鉛后海馬神

15、經(jīng)元細(xì)胞CAT活力含量則顯著升高,染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞TChE活力顯著下降,染鉛后海馬神經(jīng)元細(xì)胞MDA活力含量則顯著升高。
　　 2、在原代培養(yǎng)的鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中,鉛進(jìn)入海馬神經(jīng)元細(xì)胞后可抑制細(xì)胞增殖,鉛進(jìn)入海馬神經(jīng)元細(xì)胞后可改變正常細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量,可使海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G1期,并可抑制CyclinD1蛋白表達(dá)。
　　 3、鉛進(jìn)入海馬神經(jīng)元細(xì)胞后可誘導(dǎo)GADD153大量表達(dá),進(jìn)入海馬神經(jīng)元細(xì)胞后可使其發(fā)生D