PTEN對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后海馬神經(jīng)元的損傷作用及機(jī)制.pdf

1、近年來(lái)，創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)的發(fā)生率逐年上升，無(wú)論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家，已成為年輕人，特別是35歲以下年輕人死亡的主要原因之一。因此，有關(guān)TBI的發(fā)病機(jī)制及其治療措施的研究一直受到國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)生和神經(jīng)科學(xué)研究者的高度關(guān)注。 腦創(chuàng)傷后無(wú)論是機(jī)械性的直接損傷，還是隨后出現(xiàn)的缺血、缺氧、離子失衡以及興奮性氨基酸的毒性作用均可引起神經(jīng)元損害和死亡，并導(dǎo)致繼發(fā)性腦水腫和腦功能障礙。T

2、BI時(shí)海馬是重要的作用靶點(diǎn)，對(duì)損傷高度敏感。海馬的功能與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，它在空間信息的獲得、檢索、鞏固和存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腦創(chuàng)傷后由于海馬受損所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)、記憶功能障礙目前尚無(wú)有效的治療措施，它是造成TBI救治效果差、傷殘率高的重要原因之一。因此，研究TBI后海馬神經(jīng)元損傷的機(jī)制及防治成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 大量研究表明：谷氨酸是海馬突觸環(huán)路里最主要的一種神經(jīng)遞質(zhì)，而谷氨酸及其受體的作用也一直是TBI分子機(jī)制

3、研究的重要內(nèi)容。近年來(lái)針對(duì)谷氨酸(glutamate，Glu)受體研制了多種拮抗藥物，但其效果均不盡人意，而且存在明顯的副作用。其原因是由于這些藥物的特異性不強(qiáng)，在阻斷鈣離子的同時(shí)，也阻斷了正常的突觸內(nèi)信息傳遞。因此，深入研究海馬細(xì)胞Glu受體亞單位在TBI后的表達(dá)變化、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控過(guò)程，不僅對(duì)于深化認(rèn)識(shí)TBI的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論意義，而且對(duì)于設(shè)計(jì)出特異性更強(qiáng)、且副作用更小的谷氨酸受體阻斷藥物具有重要的臨床價(jià)值。 谷氨酸受體包括

4、代謝型(G蛋白耦聯(lián)的受體)和離子通道型兩類受體。其中離子通道型Glu受體分為N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體和海人藻酸(KA)受體。研究表明海馬CA1區(qū)NMDA和AMPA受體的含量均高于其它腦區(qū)，正常情況下該區(qū)神經(jīng)細(xì)胞膜上的NMDA受體對(duì)鈣離子有較高通透性，而AMPA受體對(duì)鈣離子不通透。AMPA受體介導(dǎo)神經(jīng)元鈣離子通透性的作用主要與GIuR2亞單位有關(guān)，其中含有GluR2亞單位的AMPA受

5、體不通透鈣離子，不含GluR2亞基的AMPA受體則對(duì)鈣離子有很高的通透性。有關(guān)NMDA受體在TBI中的作用已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究。通過(guò)阻斷NMDA受體可對(duì)TBI后海馬神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，但仍然未達(dá)到預(yù)期的效果。目前有關(guān)AMPA受體在TBI后的生物學(xué)作用卻引起了廣泛的關(guān)注。 最近研究報(bào)道大鼠腦缺血損傷可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元突觸后膜表面含有GluR2的AMPA受體數(shù)量顯著減少，而不含GluR2的AMPA受體在突觸后膜形成增多，導(dǎo)致

6、鈣離子內(nèi)流增加及傷后神經(jīng)元死亡數(shù)量明顯增多，但其具體的機(jī)制仍然不清楚。 AMPA受體是一種膜受體，神經(jīng)細(xì)胞膜受體的功能雖然受細(xì)胞內(nèi)外多種過(guò)程的調(diào)節(jié)，但磷酸化作用對(duì)膜受體功能的影響最重要。PTEN基因，即第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten。PTEN)，是1997年克隆出的一種新型腫瘤抑制基因，PTEN可使(

7、PI3、4、5P3)脫磷酸，從而阻斷PI3K信號(hào)通路，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，PTEN可阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、聚集和粘附。最近的研究提示PTEN參與了腦缺血損傷的過(guò)程，并與興奮性氨酸受體NMDAR的生物學(xué)功能具有一定的聯(lián)系。而有關(guān)創(chuàng)傷性腦損傷所導(dǎo)致海馬損傷過(guò)程中，PTEN的表達(dá)變化及其與興奮性谷氨酸AMPA受體相互作用的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 鑒于此，我們首先通過(guò)Impactor II重物打擊裝置制備了中度

8、腦創(chuàng)傷模型，并利用細(xì)胞培養(yǎng)、神經(jīng)病理、行為學(xué)以及分子生物學(xué)等技術(shù)方法，通過(guò)離體和在體實(shí)驗(yàn)觀察PTEN與TBI后海馬神經(jīng)元形態(tài)和功能變化的關(guān)系及其對(duì)AMPA受體的調(diào)控作用，并初步分析PTEN在TBI后海馬神經(jīng)元損傷中的調(diào)控作用，探討其作用機(jī)制。 主要技術(shù)方法： 1.采用Wise Young改良的Impactor-II重物打擊裝置，通過(guò)對(duì)大鼠右側(cè)大腦皮層進(jìn)行打擊，制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。 2.用50g.cm的打擊強(qiáng)度制

9、備中度腦創(chuàng)傷模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、單純損傷組和PTEN抑制劑bpv側(cè)腦室注射治療組，利用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)PTEN mRNA及蛋白表達(dá)的變化，采用TUNEL和NF-200免疫熒光染色檢測(cè)了損傷不同時(shí)間海馬神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)元的存活情況。 3.利用體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，制備了牽張損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、單純損傷組和bpv處理組，利用免疫熒光染色觀察了各組神經(jīng)元損

10、傷后GluR2表達(dá)的變化。同時(shí)通過(guò)PI染色檢測(cè)了損傷后神經(jīng)元的死亡情況。 4.利用Western blot和RT-PCR檢測(cè)了培養(yǎng)神經(jīng)元牽張損傷后神經(jīng)元細(xì)胞PTEN和磷酸化PTEN以及GluR2表達(dá)情況，并通過(guò)Fura-3標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子。利用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)掃描檢測(cè)了損傷情況下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。 1.采用Wise Young改良的Impactor-II重物打擊裝置，通過(guò)對(duì)大鼠右側(cè)大腦皮層進(jìn)行20g.

11、cm、50g.cm、100g.cm強(qiáng)度的打擊后，制備了輕、中、重度的創(chuàng)傷性腦損傷模型。 2.中度TBI后損傷側(cè)海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，在1天時(shí)達(dá)到高峰，并維持到第3天，7天后顯著減少，提示TBI造成海馬損害具有區(qū)域選擇性，CA1區(qū)神經(jīng)元對(duì)損傷最敏感。TBI后傷側(cè)海馬神經(jīng)元PTENmRNA的表達(dá)升高，12小時(shí)到達(dá)高峰：同時(shí)PTEN蛋白在傷后24小時(shí)增加最為顯著，表明PTEN參與了TBI的病理生理變化過(guò)程。通過(guò)側(cè)腦室注射

12、PTEN蛋白的抑制劑bpv后，可減少TBI后海馬神經(jīng)元的凋亡和丟失。 3.培養(yǎng)海馬神經(jīng)元牽張損傷后，PTENmRNA和蛋白的表達(dá)均增加，同時(shí)死亡神經(jīng)元的數(shù)量也明顯增加，在給予10.nM、20.nM和50.nM PTEN抑制劑bpv預(yù)處理后，可減少神經(jīng)元的死亡，其中200nM bpv對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用明顯好于100nM，但與50.nM組無(wú)顯著差別，提示PTEN抑制劑對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性。 4.通過(guò)We

13、stern blot檢測(cè)首次觀察到，培養(yǎng)海馬神經(jīng)元牽張損傷后12、24和72小時(shí)，損傷組和bpv組PTEN和p-PTEN的水平均明顯高于正常對(duì)照組，各時(shí)相點(diǎn)損傷組和bpv治療組間PTEN的表達(dá)卻無(wú)顯著差異。但bpv治療組中p-PTEN的表達(dá)水平在各時(shí)相點(diǎn)均低于損傷組，表明bpv對(duì)損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞PTEN的磷酸化水平具有一定的抑制作用。 5.培養(yǎng)海馬神經(jīng)元牽張損傷后，免疫熒光染色提示細(xì)胞膜上GluR2蛋白的表達(dá)減少并對(duì)鈣離子的通

14、透性增加，在給予PTEN抑制劑bpv的條件下，可有效抑制膜表面GluR2的減少及鈣離子的內(nèi)流。通過(guò)Western blot檢測(cè)觀察到細(xì)胞總GIuR2蛋白的表達(dá)無(wú)顯著變化，提示PTEN抑制劑bpv通過(guò)抑制PTEN的磷酸酶活性，阻止神經(jīng)元細(xì)胞膜上AMPA受體中GluR2亞單位的減少，減輕細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，這可能PTEN抑制劑對(duì)AMPA受體進(jìn)行調(diào)控并對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用的重要機(jī)制。 6.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)掃描Fura-3熒光強(qiáng)度

15、變化觀察到：阻斷培養(yǎng)神經(jīng)元NMDA受體，可部分阻止谷氨酸刺激所引起的鈣離子內(nèi)流；同時(shí)給予bpv和NMDA受體拮抗劑(MK-801)可明顯減少、但不能完全阻止谷氨酸刺激所引起的鈣離子內(nèi)流；在給予bpv+ MK801+LN294002預(yù)處理的神經(jīng)元后，由谷氨酸刺激所引起的鈣離子明顯高于bpv+MK801預(yù)處理組，表明PTEN對(duì)損傷神經(jīng)元AMPA受體的調(diào)控是通過(guò)P13K-Akt通路發(fā)揮作用。 結(jié)論： 1.TBI后腦組織的損害具

16、有選擇性，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對(duì)損傷因素最敏感。本研究首次觀察到PTEN參與了TBI后海馬神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷過(guò)程，并與神經(jīng)元的凋亡具有一定的關(guān)系。 2.體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTEN抑制劑bpv對(duì)損傷海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。 3.本課題首次觀察到PTEN抑制劑bpv是通過(guò)抑制PTEN的磷酸酶活性，阻止神經(jīng)元細(xì)胞膜上AMPA受體中GluR2亞單位的減少，減輕細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流而實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用。 4.PTEN對(duì)GI