PTEN對大鼠腦創(chuàng)傷后海馬神經元的損傷作用及機制.pdf

1、近年來，創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)的發(fā)生率逐年上升，無論是在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，已成為年輕人，特別是35歲以下年輕人死亡的主要原因之一。因此，有關TBI的發(fā)病機制及其治療措施的研究一直受到國內外臨床醫(yī)生和神經科學研究者的高度關注。 腦創(chuàng)傷后無論是機械性的直接損傷，還是隨后出現(xiàn)的缺血、缺氧、離子失衡以及興奮性氨基酸的毒性作用均可引起神經元損害和死亡，并導致繼發(fā)性腦水腫和腦功能障礙。T

2、BI時海馬是重要的作用靶點，對損傷高度敏感。海馬的功能與學習記憶密切相關，它在空間信息的獲得、檢索、鞏固和存儲過程中發(fā)揮重要作用。腦創(chuàng)傷后由于海馬受損所導致的學習、記憶功能障礙目前尚無有效的治療措施，它是造成TBI救治效果差、傷殘率高的重要原因之一。因此，研究TBI后海馬神經元損傷的機制及防治成為近年來國內外關注的熱點和難點。 大量研究表明：谷氨酸是海馬突觸環(huán)路里最主要的一種神經遞質，而谷氨酸及其受體的作用也一直是TBI分子機制

3、研究的重要內容。近年來針對谷氨酸(glutamate，Glu)受體研制了多種拮抗藥物，但其效果均不盡人意，而且存在明顯的副作用。其原因是由于這些藥物的特異性不強，在阻斷鈣離子的同時，也阻斷了正常的突觸內信息傳遞。因此，深入研究海馬細胞Glu受體亞單位在TBI后的表達變化、轉運調控過程，不僅對于深化認識TBI的發(fā)病機制具有重要的理論意義，而且對于設計出特異性更強、且副作用更小的谷氨酸受體阻斷藥物具有重要的臨床價值。 谷氨酸受體包括

4、代謝型(G蛋白耦聯(lián)的受體)和離子通道型兩類受體。其中離子通道型Glu受體分為N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體和海人藻酸(KA)受體。研究表明海馬CA1區(qū)NMDA和AMPA受體的含量均高于其它腦區(qū)，正常情況下該區(qū)神經細胞膜上的NMDA受體對鈣離子有較高通透性，而AMPA受體對鈣離子不通透。AMPA受體介導神經元鈣離子通透性的作用主要與GIuR2亞單位有關，其中含有GluR2亞單位的AMPA受

5、體不通透鈣離子，不含GluR2亞基的AMPA受體則對鈣離子有很高的通透性。有關NMDA受體在TBI中的作用已經進行了廣泛的研究。通過阻斷NMDA受體可對TBI后海馬神經元細胞具有一定的保護作用，但仍然未達到預期的效果。目前有關AMPA受體在TBI后的生物學作用卻引起了廣泛的關注。 最近研究報道大鼠腦缺血損傷可導致海馬神經元突觸后膜表面含有GluR2的AMPA受體數(shù)量顯著減少，而不含GluR2的AMPA受體在突觸后膜形成增多，導致

6、鈣離子內流增加及傷后神經元死亡數(shù)量明顯增多，但其具體的機制仍然不清楚。 AMPA受體是一種膜受體，神經細胞膜受體的功能雖然受細胞內外多種過程的調節(jié)，但磷酸化作用對膜受體功能的影響最重要。PTEN基因，即第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten。PTEN)，是1997年克隆出的一種新型腫瘤抑制基因，PTEN可使(

7、PI3、4、5P3)脫磷酸，從而阻斷PI3K信號通路，抑制細胞生長。此外，PTEN可阻斷細胞周期，誘導細胞凋亡，抑制細胞的轉移、擴散、聚集和粘附。最近的研究提示PTEN參與了腦缺血損傷的過程，并與興奮性氨酸受體NMDAR的生物學功能具有一定的聯(lián)系。而有關創(chuàng)傷性腦損傷所導致海馬損傷過程中，PTEN的表達變化及其與興奮性谷氨酸AMPA受體相互作用的關系目前尚未見報道。 鑒于此，我們首先通過Impactor II重物打擊裝置制備了中度

8、腦創(chuàng)傷模型，并利用細胞培養(yǎng)、神經病理、行為學以及分子生物學等技術方法，通過離體和在體實驗觀察PTEN與TBI后海馬神經元形態(tài)和功能變化的關系及其對AMPA受體的調控作用，并初步分析PTEN在TBI后海馬神經元損傷中的調控作用，探討其作用機制。 主要技術方法： 1.采用Wise Young改良的Impactor-II重物打擊裝置，通過對大鼠右側大腦皮層進行打擊，制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。 2.用50g.cm的打擊強度制

9、備中度腦創(chuàng)傷模型，實驗動物分為對照組、單純損傷組和PTEN抑制劑bpv側腦室注射治療組，利用免疫組織化學、RT-PCR、Western Blot方法檢測腦創(chuàng)傷后不同時間點PTEN mRNA及蛋白表達的變化，采用TUNEL和NF-200免疫熒光染色檢測了損傷不同時間海馬神經元的凋亡和神經元的存活情況。 3.利用體外培養(yǎng)的海馬神經元，制備了牽張損傷模型，實驗分為正常對照組、單純損傷組和bpv處理組，利用免疫熒光染色觀察了各組神經元損

10、傷后GluR2表達的變化。同時通過PI染色檢測了損傷后神經元的死亡情況。 4.利用Western blot和RT-PCR檢測了培養(yǎng)神經元牽張損傷后神經元細胞PTEN和磷酸化PTEN以及GluR2表達情況，并通過Fura-3標記神經元細胞內游離鈣離子。利用激光共聚焦顯微鏡實時掃描檢測了損傷情況下細胞內鈣離子濃度的變化。 1.采用Wise Young改良的Impactor-II重物打擊裝置，通過對大鼠右側大腦皮層進行20g.

11、cm、50g.cm、100g.cm強度的打擊后，制備了輕、中、重度的創(chuàng)傷性腦損傷模型。 2.中度TBI后損傷側海馬CA1區(qū)凋亡神經元數(shù)量顯著增加，在1天時達到高峰，并維持到第3天，7天后顯著減少，提示TBI造成海馬損害具有區(qū)域選擇性，CA1區(qū)神經元對損傷最敏感。TBI后傷側海馬神經元PTENmRNA的表達升高，12小時到達高峰：同時PTEN蛋白在傷后24小時增加最為顯著，表明PTEN參與了TBI的病理生理變化過程。通過側腦室注射

12、PTEN蛋白的抑制劑bpv后，可減少TBI后海馬神經元的凋亡和丟失。 3.培養(yǎng)海馬神經元牽張損傷后，PTENmRNA和蛋白的表達均增加，同時死亡神經元的數(shù)量也明顯增加，在給予10.nM、20.nM和50.nM PTEN抑制劑bpv預處理后，可減少神經元的死亡，其中200nM bpv對神經元的保護作用明顯好于100nM，但與50.nM組無顯著差別，提示PTEN抑制劑對損傷神經元的保護作用具有一定的劑量依賴性。 4.通過We

13、stern blot檢測首次觀察到，培養(yǎng)海馬神經元牽張損傷后12、24和72小時，損傷組和bpv組PTEN和p-PTEN的水平均明顯高于正常對照組，各時相點損傷組和bpv治療組間PTEN的表達卻無顯著差異。但bpv治療組中p-PTEN的表達水平在各時相點均低于損傷組，表明bpv對損傷海馬神經元細胞PTEN的磷酸化水平具有一定的抑制作用。 5.培養(yǎng)海馬神經元牽張損傷后，免疫熒光染色提示細胞膜上GluR2蛋白的表達減少并對鈣離子的通

14、透性增加，在給予PTEN抑制劑bpv的條件下，可有效抑制膜表面GluR2的減少及鈣離子的內流。通過Western blot檢測觀察到細胞總GIuR2蛋白的表達無顯著變化，提示PTEN抑制劑bpv通過抑制PTEN的磷酸酶活性，阻止神經元細胞膜上AMPA受體中GluR2亞單位的減少，減輕細胞外鈣離子內流，這可能PTEN抑制劑對AMPA受體進行調控并對神經元產生保護作用的重要機制。 6.通過激光共聚焦顯微鏡實時掃描Fura-3熒光強度

15、變化觀察到：阻斷培養(yǎng)神經元NMDA受體，可部分阻止谷氨酸刺激所引起的鈣離子內流；同時給予bpv和NMDA受體拮抗劑(MK-801)可明顯減少、但不能完全阻止谷氨酸刺激所引起的鈣離子內流；在給予bpv+ MK801+LN294002預處理的神經元后，由谷氨酸刺激所引起的鈣離子明顯高于bpv+MK801預處理組，表明PTEN對損傷神經元AMPA受體的調控是通過P13K-Akt通路發(fā)揮作用。 結論： 1.TBI后腦組織的損害具

16、有選擇性，海馬CA1區(qū)神經元對損傷因素最敏感。本研究首次觀察到PTEN參與了TBI后海馬神經元的繼發(fā)性損傷過程，并與神經元的凋亡具有一定的關系。 2.體內、外實驗證實PTEN抑制劑bpv對損傷海馬神經元具有保護作用。 3.本課題首次觀察到PTEN抑制劑bpv是通過抑制PTEN的磷酸酶活性，阻止神經元細胞膜上AMPA受體中GluR2亞單位的減少，減輕細胞外鈣離子內流而實現(xiàn)對損傷神經元的保護作用。 4.PTEN對GI