人胰島淀粉樣多肽損傷大鼠海馬神經(jīng)元的機制研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）與二型糖尿?。╰ypeⅡdiabetes mellitus, DM2）是兩種常見的年齡相關性疾病。二者具有相似的流行病學及生物化學特征，且均與蛋白質(zhì)聚集，最終形成纖維狀結(jié)構(gòu)有關——胰島淀粉樣多肽（Amylin）聚集于DM2的胰腺組織，β淀粉樣蛋白（Aβ）聚集于AD的腦組織。大量研究表明，兩種疾病具有明顯的相關性。Amylin寡聚體在腦內(nèi)的出現(xiàn)被認為是導致AD發(fā)生發(fā)展的新危險因素

2、。雖然Amylin已被證實，其聚集過程可改變內(nèi)鈣（[Ca2+]i）穩(wěn)態(tài)，進而損傷胰島β細胞，但其神經(jīng)毒性機制仍不清楚。本文中，我們應用離子成像、全細胞膜片鉗及免疫熒光等技術，探究Amylin對大鼠海馬神經(jīng)元的損傷機制。
　　大量報道指出，Aβ蛋白在細胞膜表面形成寡聚體的過程中，可以產(chǎn)生大量的ROS，從而破壞細胞膜的穩(wěn)定性。我們猜想高濃度hAmylin對神經(jīng)元的損傷機制可能與之相似。因此，我們借助免疫熒光、活細胞工作站及掃描電鏡，進

3、一步探究hAmylin對神經(jīng)元細胞膜穩(wěn)定性的影響。
　　第一部分：胰島淀粉樣多肽對大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣的影響
　　目的：分析不同來源、不同濃度的Amylin對原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響及其機制。
　　方法：培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，應用免疫熒光技術鑒定神經(jīng)元純度，及相關受體表達。利用鈣成像技術記錄神經(jīng)元[Ca2+]i變化。利用免疫熒光觀察Amylin受體的表達量。利用透射電鏡觀察Amylin的聚集狀態(tài)。

4、
　　結(jié)果：
　　1.原代海馬神經(jīng)元純度鑒定
　　神經(jīng)元細胞純度>98％
　　2.Amylin對原代海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響
　　應用不同濃度的hAmylin對原代大鼠海馬神經(jīng)元進行干預，發(fā)現(xiàn)1-30μM的hAmylin可誘導神經(jīng)元[Ca2+]i顯著增加（P<0.05）。神經(jīng)元對3μM和10μM hAmylin的反應率分別為38.46%和55.05%。10μM hAmylin可使R(340/380)增

5、長67.6±17.5%，EC50約等于2.53μM。海馬神經(jīng)元[Ca2+]i在給予10μM hAmylin約10 s后達峰，且可維持在峰值，無衰減。在撤藥洗脫后約30 s，[Ca2+]i可恢復至基線。重復給藥[Ca2+]i增加的峰值未見明顯變化（P>0.05），說明沒有藥物脫敏現(xiàn)象。
　　大約10%的神經(jīng)元在給予10μM鼠來源的Amylin（rAmylin）及普蘭林泰（hAmylin類似物，不發(fā)生聚集）后，產(chǎn)生[Ca2+]i增加現(xiàn)

6、象。R(340/380)增長分別為22.1±4.0%和24.8±7.0%，與應用10μM hAmylin相比，反應顯著降低（P<0.001）。
　　10μM Amylin受體抑制劑AC187或AC253本身并不影響神經(jīng)元[Ca2+]i，但可阻斷1μM hAmylin、10μM普蘭林泰及10μM rAmylin的作用，而10μM hAmylin所導致的[Ca2+]i增加現(xiàn)象不受影響。說明低濃度（1μM）hAmylin、10μM普蘭林

7、泰及10μM rAmylin所引起的[Ca2+]i增加現(xiàn)象是一種受體依賴的機制，而高濃度（10μM）hAmylin所引起的內(nèi)鈣增加現(xiàn)象是一種非受體依賴的機制。
　　3.Amylin受體RAMP在胎鼠海馬神經(jīng)元及成年大鼠腦片海馬區(qū)的表達
　　應用免疫熒光技術，我們發(fā)現(xiàn)Amylin受體RAMP1、2亞型在胎鼠海馬神經(jīng)元及大鼠腦片海馬區(qū)均有高表達。RAMP3亞型僅在胎鼠海馬神經(jīng)元高表達，而成年大鼠腦片海馬區(qū)表達量較低。
　　

8、4.濃度對hAmylin聚集的影響
　　我們推測高濃度（10μM）hAmylin所誘導的[Ca2+]i增加與hAmylin的聚集有關。因此，我們應用透射電鏡對hAmylin的聚集狀態(tài)進行觀察。高濃度hAmylin（10μM）在37℃孵育1 h和24 h后，分別觀察到寡聚體及纖維狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。而在低濃度hAmylin（1μM）溶液中并未觀察到類似結(jié)構(gòu)。說明hAmylin誘導[Ca2+]i增加的非受體依賴機制，可能與其在高濃度下更容易

9、出現(xiàn)錯誤折疊，產(chǎn)生寡聚體及纖維狀結(jié)構(gòu)的特性有關。
　　第二部分：人胰島淀粉樣多肽對TRPV4的興奮性調(diào)節(jié)作用
　　目的：探究高濃度hAmylin誘導神經(jīng)元[Ca2+]i增加的非受體依賴機制
　　方法：培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，利用鈣成像技術記錄神經(jīng)元[Ca2+]i變化，利用全細胞膜片鉗技術記錄細胞靜息電位。利用scRT-PCR，及siRNA技術探究TRPV4在hAmylin誘導[Ca2+]i增加反應中的作用。

10、　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)細胞膜鈣通透性離子通道與hAmylin誘導的[Ca2+]i增加
　　細胞[Ca2+]i增加的來源只能是胞外鈣內(nèi)流或（和）胞內(nèi)鈣庫釋放。為探究hAmylin所誘導的[Ca2+]i增加是否來源于外鈣。我們使用了無鈣細胞外液，并加入0.1 mM EGTA鰲合殘存的外鈣。在無鈣外液中，10μM hAmylin誘導[Ca2+]i增加的現(xiàn)象消失。說明細胞膜上的鈣離子通道在hAmylin誘導[Ca2+]i增加的現(xiàn)象

11、中扮演重要角色。
　　為進一步排除胞內(nèi)鈣庫釋放對該現(xiàn)象的影響，我們給予5μM環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid, CPA）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶抑制劑，孵育1 min后，引起神經(jīng)元[Ca2+]i增加。隨后，再次給予hAmylin仍可引起神經(jīng)元[Ca2+]i的快速增加，且增加程度與不應用CPA相比無明顯變化（P>0.05）。用1μM毒胡蘿卜素（thapsigargin, TG）替代CPA，重復該實驗得到相同結(jié)果。說明增加的[

12、Ca2+]i主要來源于胞外鈣內(nèi)流，而非胞內(nèi)鈣庫釋放。
　　2.電壓門控性鈣離子通道與hAmylin誘導的神經(jīng)細胞[Ca2+]i增加
　　我們利用膜片鉗技術檢測hAmylin對神經(jīng)細胞膜靜息電位的影響。我們發(fā)現(xiàn)在給予hAmylin后，細胞膜靜息電位由-55.67±2.35mV上升至-35.00±2.80 mV。個別細胞還觀察到動作電位的產(chǎn)生?？紤]到細胞膜靜息電位去極化至-40 mV時，即可激活L型鈣通道。因此我們認為hAmyl

13、in誘導[Ca2+]i增加的現(xiàn)象有電壓門控性鈣離子通道參與。
　　我們給予L型鈣通道阻斷劑氨氯地平（5μM）或N型鈣通道阻斷劑芋螺霉素（1μM）孵育1 min后，hAmylin誘導的R(340/380)增加率分別為44.49±13.84%和52.84±13.23%，與單獨應用 hAmylin（67.98±14.85%）相比，有明顯差異（P<0.01）。說明電壓門控性鈣離子通道參與了hAmylin誘導神經(jīng)元[Ca2+]i增加。然而，

14、即便在同時給予氨氯地平和芋螺霉素時，仍不能完全抑制hAmylin的作用，提示仍有其他的鈣通透性通道參與該反應。
　　3.hAmylin誘導的神經(jīng)細胞[Ca2+]i增加依賴于外鈉參與
　　為探究hAmylin導致神經(jīng)細胞膜去極化的機制，我們用NMDG（一種不透過陽離子通道的大體積有機陽離子）代替了細胞外液中的Na+。在無鈉外液中，hAmylin誘導[Ca2+]i增加的現(xiàn)象被顯著抑制。反應陽性率降至18.2%，反應強度由65.3

15、9±15.91%降至34.34±4.57%（P<0.001）。說明hAmylin誘導[Ca2+]i增加依賴于外鈉內(nèi)流，進而使細胞膜去極化，膜靜息電位抬高。有趣的是，當我們在正常外液中加入TTX（1μM）后，hAmylin誘導[Ca2+]i增加的現(xiàn)象無明顯變化（P>0.05），說明電壓門控性鈉離子通道并不參與該反應。甚至在無鈉外液中加入氨氯地平，仍然無法完全阻斷hAmylin誘導的[Ca2+]i增加現(xiàn)象。因此我們考慮，可能有非選擇性陽離子

16、通道（如TRP家族）于上游進行調(diào)控。
　　4.TRPV4參與hAmylin誘導的神經(jīng)細胞[Ca2+]i增加
　　我們在給予TRP通道廣譜抑制劑RR（10μM）后，hAmylin誘導海馬神經(jīng)元[Ca2+]i增加的現(xiàn)象被顯著抑制（P<0.01）。靜息電位抬高了8.8±1.1 mV，與單獨應用hAmylin（21.4±1.7 mV）相比，有顯著差異（P<0.001）。
　　為進一步探究參與反應的是TRP家族中的哪一種亞型，我

17、們應用單細胞RT-PCR技術檢測hAmylin反應陽性的海馬神經(jīng)元。發(fā)現(xiàn)6/7的陽性海馬神經(jīng)元表達TRPV4亞型，這與胰島β細胞的結(jié)果一致。之后，我們使用TRPV4通道的選擇性抑制劑HC067047（1μM）進行干預，發(fā)現(xiàn)hAmylin誘導神經(jīng)元[Ca2+]i增加的現(xiàn)象被顯著抑制（P<0.01）。靜息電位抬高7.4±1.1 mV，與單獨應用hAmylin（21.4±1.7 mV）相比，有顯著差異（P<0.001）。
　　在成年SD

18、大鼠的腦切片中，TRPV4在海馬區(qū)的表達很低，這與之前報道相一致。然而，在原代培養(yǎng)的SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元中，TRPV4在部分神經(jīng)元中表達，陽性率為54%，這與鈣成像hAmylin反應陽性率相一致。
　　為進一步確證TRPV4參與hAmylin誘導的[Ca2+]i增加，我們應用TRPV4通道激動劑（GSK1016790A,100 nM）對海馬神經(jīng)元進行干預。我們發(fā)現(xiàn)GSK1016790A與hAmylin誘導細胞[Ca2+]i增加的

19、現(xiàn)象總是相伴出現(xiàn)在同一神經(jīng)細胞。hAmylin的反應低于GSK1016790A。我們利用siRNA技術將TRPV4通道敲低后，GSK1016790A及hAmylin誘導的[Ca2+]i增加較未敲低組顯著降低（P<0.05）。說明TRPV4通道是hAmylin誘導神經(jīng)元[Ca2+]i增加上游反應的關鍵靶點，這一結(jié)果與胰島β細胞的研究一致。
　　為探究hAmylin是否可以直接激活TRPV4通道，我們對轉(zhuǎn)染TRPV4通道的HEK293

20、細胞，直接給予GSK1016790A（100 nM）與hAmylin。發(fā)現(xiàn)GSK1016790A誘導[Ca2+]i增加的反應仍然存在，而hAmylin誘導[Ca2+]i增加的反應消失。說明hAmylin并非直接激活TRPV4通道，或其需要某些因素共同參與時才可激活該通道。
　　第三部分：人胰島淀粉樣多肽對細胞膜穩(wěn)定性的影響
　　目的：探究hAmylin激活TRPV4的機制
　　方法：培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，應用離子

21、成像技術記錄神經(jīng)元[Ca2+]i變化，線粒體膜電位的變化及ROS的生成。利用免疫熒光、活細胞工作站、掃描電鏡觀察hAmylin對細胞膜穩(wěn)定性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.hAmylin聚集狀態(tài)的觀察
　　我們將N端標記FAM熒光的hAmylin加入細胞培養(yǎng)基中，37℃孵育15 min后，更換培養(yǎng)基，可觀察到聚合的hAmylin熒光。用新鮮培養(yǎng)基進一步搖床洗脫之后，熒光消失。說明hAmylin更容易在細胞表面發(fā)生聚集，而

22、沒有進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。為分析hAmylin的聚合過程是否可逆，我們在更換培養(yǎng)基后，持續(xù)觀察聚合的hAmylin熒光12 h，熒光并未減少。說明hAmylin聚合的過程是不可逆的。
　　2.hAmylin長時間作用對神經(jīng)元形態(tài)的影響
　　我們利用活細胞工作站，對高濃度（10μM）hAmylin作用下的神經(jīng)元形態(tài)進行長時間觀察。10μM hAmylin作用約4 h后，神經(jīng)元開始出現(xiàn)核固縮；約9h后，可觀察到細胞凋亡。
　

23、　3.hAmylin對海馬組織的直接影響
　　為了觀察hAmylin對海馬組織的直接影響，我們給成年大鼠側(cè)腦室注射5μL的10μM hAmylin，并于24 h后處死取腦，行冰凍切片。利用免疫熒光染色技術，我們觀察到hAmylin導致的海馬區(qū)神經(jīng)元缺失。在我們的實驗中，并未觀察到明顯的小膠質(zhì)細胞浸潤，說明炎癥反應并非造成神經(jīng)元缺失的主要原因。
　　4.hAmylin對細胞膜完整性的影響
　　我們猜想hAmylin誘導神

24、經(jīng)元[Ca2+]i增加可能與其寡聚體能在細胞膜表面形成非選擇性離子通透性孔道有關。我們對HEK293細胞給予10μM hAmylin1 min，并未觀察到細胞[Ca2+]i的變化。在全細胞電壓鉗下也同樣未觀察到hAmylin引起電流變化。
　　利用免疫熒光技術，對神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)分別進行特異性抗體染色。用hAmylin替代打孔劑Triton X-100后發(fā)現(xiàn)。神經(jīng)元經(jīng)短時間（1 min） hAmylin孵育后，鏡下即可觀察到免疫熒

25、光。而膠質(zhì)細胞短時間（1 min） hAmylin孵育后，并未觀察到免疫熒光。若孵育時間延長至30 min，則神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞于鏡下均可觀察到相應免疫熒光。說明hAmylin在細胞表面聚合過程中，確實可以導致細胞膜完整性的破壞，使一抗進入細胞內(nèi)。但不同種類的細胞膜，所需孵育時間不同。這可能是導致hAmylin在短時間內(nèi)，無法增加HEK293細胞[Ca2+]i的原因。
　　為進一步確證hAmylin對細胞膜穩(wěn)定性的影響，我們利用掃描

26、電鏡對細胞進行觀察。發(fā)現(xiàn)經(jīng)hAmylin孵育后，神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞膜完整性遭到破壞。對HEK293細胞轉(zhuǎn)染LifeAct質(zhì)粒，標記細胞骨架（F-actin）后，在活細胞工作站中，觀察hAmylin長時間作用。結(jié)果顯示，10μM hAmylin的長時間作用同樣可對HEK293細胞的細胞骨架造成損傷。
　　5.hAmylin對神經(jīng)元ROS生成及線粒體膜電位的影響
　　有報道指出，Aβ蛋白破壞細胞膜完整性的機制主要與其在細胞表面聚合

27、時生成ROS有關。我們猜想hAmylin破壞細胞膜完整性的機制可能與此相同。我們利用離子成像技術，對神經(jīng)元ROS的生成進行觀察。發(fā)現(xiàn)高濃度（10μM）hAmylin可以明顯增加神經(jīng)元ROS的生成（P<0.001），而低濃度（1μM）hAmylin無此作用。說明ROS的生成主要與hAmylin的聚合有關。
　　我們利用JC-1染料，進一步觀察hAmylin對神經(jīng)元線粒體膜電位的影響。發(fā)現(xiàn)高濃度（10μM）hAmylin可以明顯降低線

28、粒體膜電位，而低濃度（1μM）hAmylin無此作用。當給予線粒體PTP開放抑制劑CsA（1μM）后，高濃度（10μM）hAmylin所導致的線粒體膜電位降低現(xiàn)象被顯著抑制（P<0.001），但不能抑制它所導致的[Ca2+]i增加及ROS的生成。說明hAmylin誘發(fā)的[Ca2+]i增加以及ROS生成還有其他機制。
　　結(jié)論：
　　hAmylin通過受體依賴及非受體依賴兩種機制誘導大鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i增加；低濃度hA