石菖蒲單體對β-淀粉樣蛋白致神經元損傷模型的保護作用研究.pdf

1、研究背景：
　　阿爾茲海默癥(Alzheimer‘s Disease，AD)是一種最為常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，為癡呆的最主要類型。目前―Aβ假說‖被廣泛地接受為AD最主要的發(fā)病機理，即老年斑的主要組成成分——β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)是AD發(fā)病進程的中心機制，其在特定腦區(qū)內聚集，引發(fā)相應的神經毒性作用，造成突觸損傷，神經元死亡，從而導致了AD患者記憶衰退和認知功能障礙等相應癥狀的產生。
　　目前，AD的

2、治療研究策略主要包括三個方面：一是開發(fā)新的低毒性的擬膽堿藥物；二是神經營養(yǎng)物質的應用，包括直接腦室灌注神經營養(yǎng)因子和神經營養(yǎng)因子基因修飾細胞的腦內移植治療；三是干細胞的移植治療。但這些療法基本在于減慢神經元的退變或加速神經元的產生，并沒有從根本上阻止AD患者的病變，其遠期治療前景不容樂觀。而中醫(yī)藥臨床表明，以石菖蒲為主的藥方是治療AD方劑的基本結構，位居單味藥使用頻次第1位，療效肯定。但石菖蒲抗AD的藥效部位及抗AD的―Aβ‖機制尚未闡

3、明，影響了石菖蒲抗AD療效的進一步提高。
　　我室前期工作證明，石菖蒲揮發(fā)油部位對AD模型小鼠學習記憶能力有明顯提升作用，作用機制可能與其拮抗凋亡相關因子表達有關，提示揮發(fā)油部位有可能用于AD的防治。為進一步探討石菖蒲揮發(fā)油部位抗AD及其發(fā)揮神經保護作用的有效成分，為石菖蒲抗AD及用于神經保護藥物的研發(fā)提供科學依據，本實驗首先用Aβ1-42寡聚體對體外培養(yǎng)的原代皮層神經元進行優(yōu)化篩選，建立了 Aβ1-42寡聚體致神經元損傷模型。在

4、此模型上探討β-細辛醚（β-asarone）、丁香酚（Eugenol）以及β-細辛醚聯(lián)合丁香酚共孵育對 Aβ1-42致神經元損傷模型的保護作用及機制，為石菖蒲抗AD及用于神經保護藥物的研發(fā)提供科學依據。
　　研究目的：
　　1.觀察β-細辛醚和丁香酚對正常狀態(tài)下原代皮層神經元和PC12細胞的形態(tài)和細胞活力的影響，初步了解β-細辛醚和丁香酚的神經保護作用；
　　2.觀察β-細辛醚、丁香酚及β-細辛醚聯(lián)合丁香酚共孵育對Aβ

5、1-42寡聚體誘導的原代皮層神經元和PC12細胞損傷模型的保護作用，并探討其作用機理。
　　研究方法：
　　實驗一
　　1．首先取胎鼠的皮層組織進行原代皮層神經元的培養(yǎng)，培養(yǎng)第六天進行免疫細胞化學染色鑒定神經元；
　　2． Aβ1-42寡聚體誘導的皮層神經元損傷模型的建立，ELISA檢測相關因子的釋放水平；
　　3．觀察β-細辛醚和丁香酚對皮層神經元的細胞活力的影響；
　　4．原代皮層神經元培養(yǎng)第六天

6、加入Aβ1-42寡聚體建立細胞模型，24小時后再用
　　β-細辛醚和丁香酚作用于細胞。三天后提取蛋白進行凋亡相關因子的檢測；實驗二
　　1.石菖蒲主要有效成分β-細辛醚和丁香酚對正常狀態(tài)下PC12細胞形態(tài)和細胞活力的影響；
　　2.建立PC12細胞的Aβ1-42寡聚體誘導損傷模型；
　　3. PC12細胞培養(yǎng)第六天加入Aβ1-42寡聚體建立細胞模型，24小時后再用β-細辛醚和丁香酚作用于細胞。三天后提取RNA進行

7、凋亡相關基因的檢測；
　　4.通過Tunel法探討β-細辛醚和丁香酚對Aβ1-42寡聚體誘導的PC12細胞的保護作用機理。
　　研究結果：
　　實驗一：
　　1.培養(yǎng)至第六天的原代皮層神經元胞體的突起明顯，免疫細胞化學染色顯示，神經元標志物呈陽性；
　　2.通過ELISA檢測TNF-α的釋放水平，建立起Aβ1-42寡聚體誘導的皮層神經元損傷模型；
　　3.培養(yǎng)至第三天的皮層神經元分別與10-10-10

8、-5Mβ-細辛醚、丁香酚以及β-細辛醚聯(lián)合丁香酚共孵育24h，與正常培養(yǎng)的神經元相比，10-6β-細辛醚和10-7M丁香酚組細胞存活率最高；
　　4. Western blotting技術檢測凋亡相關蛋白，顯示Aβ1-42寡聚體作用于皮層神經元6h后，促凋亡蛋白Bax表達開始增加，至24h達到較高水平；與之相反，抗凋亡蛋白Bcl-2表達隨Aβ1-42寡聚體作用時間延長逐漸降低；
　　5.10-10-10-5Mβ-細辛醚和丁香

9、酚可明顯拮抗 Aβ1-42寡聚體引起的促凋亡蛋白Bax表達上調以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降。
　　實驗二：
　　1.培養(yǎng)至第三天的PC12細胞與10-10-10-5Mβ-細辛醚和丁香酚分別共孵育24h，與正常培養(yǎng)的PC12細胞相比，10-6β-細辛醚和10-7M丁香酚組細胞存活率最高；
　　2. RT-PCR技術檢測凋亡相關基因，顯示 Aβ1-42寡聚體作用于PC12細胞后，促凋亡蛋白Bax表達開始增加，抗凋亡蛋白

10、Bcl-2表達逐漸降低；
　　3.10-10-10-5Mβ-細辛醚和丁香酚可明顯拮抗Aβ1-42寡聚體引起的PC12細胞促凋亡基因Bax表達上調以及抗凋亡基因Bcl-2表達下降；
　　4. TUNEL方法檢測PC12細胞凋亡：β-細辛醚、丁香酚及其混合物的預孵育組，與Aβ1-42寡聚體對照組相比較，陽性細胞數(shù)量明顯減少。β-細辛醚聯(lián)合丁香酚用藥組優(yōu)于單體的單獨作用組。
　　結論：
　　1. Aβ1-42寡聚體能顯