膽紅素致神經(jīng)元損傷及其機(jī)制的研究.pdf

1、膽紅素是血紅素代謝的最終產(chǎn)物，當(dāng)膽紅素代謝異常，產(chǎn)生增加或排泄減少時(shí)，總膽紅素超過(guò)34.2μmol/L，則出現(xiàn)高膽紅素血癥，臨床上即可形成黃疸。新生兒期，游離膽紅素通過(guò)血腦屏障，易發(fā)生膽紅素腦病，又稱核黃疸，其死亡率很高。但是具體的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）是真核細(xì)胞ATP依賴的非溶酶體蛋白降解系統(tǒng)。UPS在維持細(xì)胞的正常穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存中起著關(guān)鍵作用，它

2、的功能抑制可以導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。而膽紅素可以抑制蛋白酶體的活性和功能，這是否構(gòu)成膽紅素致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制？為闡述這一問(wèn)題，我們?cè)诒狙芯恐?，采用原代海馬神經(jīng)元和新生SD大鼠，觀察膽紅素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，探討膽紅素是否通過(guò)抑制蛋白酶體的活性和功能，導(dǎo)致膽紅素腦病神經(jīng)元的損傷。
　　第一部分：新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)方法的改進(jìn)與鑒定
　　目的：建立一種簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，以獲得高純度、高活力的海馬神經(jīng)

3、元。
　　方法：取出生24h內(nèi)新生鼠，斷頭取腦，置于裝有預(yù)冷D-hanks液的培養(yǎng)皿中，小心分離兩側(cè)海馬，經(jīng)0.25％胰酶消化15-20min后，終止消化，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心棄上清，加入含有B27的Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種在PDL包被的12孔板上。24h后更換含有B27的Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀態(tài)，MTS法測(cè)定不同時(shí)間神經(jīng)元細(xì)胞的活力，用Tau-1和MAP

4、2抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，鑒定海馬神經(jīng)元的純度。
　　結(jié)果：
　　1.海馬神經(jīng)元種植3h后，少部分細(xì)胞貼壁，單個(gè)均勻分布，折光性強(qiáng)，種植6h后，神經(jīng)細(xì)胞表面可呈現(xiàn)單個(gè)或者多個(gè)層狀偽足。12h后，大部分細(xì)胞貼壁，多數(shù)神經(jīng)元出現(xiàn)無(wú)分支的突起，24h后，細(xì)胞完全貼壁，可見(jiàn)雙突起和多個(gè)突起的神經(jīng)元。72h后，海馬神經(jīng)元胞體飽滿，立體感較強(qiáng)，胞漿豐富，突起之間相互形成突觸聯(lián)系，神經(jīng)元極性完全建立。5-6d的神經(jīng)元，胞體較前更飽滿，立體感

5、及折光性強(qiáng)，突起極其發(fā)達(dá)，互相連接，形成密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)。
　　2. MTS法測(cè)定結(jié)果顯示，在培養(yǎng)1-8d時(shí)間內(nèi)，海馬神經(jīng)元隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，活力增加，第8d細(xì)胞活性到達(dá)高峰，繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，活力開(kāi)始下降。
　　3.經(jīng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Tau-1和MAP2免疫熒光鑒定，海馬神經(jīng)元純度為(95.5±2.4)%，用無(wú)血清神經(jīng)元培養(yǎng)基進(jìn)行原代海馬細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)未加阿糖胞苷抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，能夠獲得高純度的海馬神經(jīng)元細(xì)胞。
　

6、　結(jié)論：采用無(wú)血清培養(yǎng)法，對(duì)24h內(nèi)的新生SD大鼠進(jìn)行海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，此方法可靠，可獲得高純度的神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)，細(xì)胞活力良好；為了減少神經(jīng)元的損傷，不采用阿糖胞苷處理，并未發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。該方法為神經(jīng)疾病體外研究提供理想的細(xì)胞材料。
　　第二部分：膽紅素致神經(jīng)元損傷及其機(jī)制的研究
　　目的：在原代海馬神經(jīng)元和高膽紅素血癥新生大鼠水平，探討膽紅素對(duì)神經(jīng)元的損傷及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.用膽

7、紅素處理原代海馬神經(jīng)元，通過(guò)倒置顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，JC-1檢測(cè)線粒體膜電位，免疫熒光法及Western-blot檢測(cè)K48、Ub及凋亡相關(guān)蛋白的變化。
　　2.新生SD大鼠腹腔注射不同濃度的膽紅素3d，2次/d后，觀察新生鼠的一般狀況并拍照，取腦組織進(jìn)行HE和尼氏染色，免疫組化及Western-blot檢測(cè)K48、Ub及凋亡相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果
　　1.海馬神經(jīng)元培養(yǎng)1d后，加入不同濃度的膽紅素繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)

8、間，結(jié)果顯示：隨著膽紅素濃度增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)受抑制的程度增加，且該抑制作用與蛋白酶體的抑制劑ps341效果相似。
　　2.海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3d后，加入不同濃度的膽紅素繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h、24h，結(jié)果顯示：隨著膽紅素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，海馬神經(jīng)元死亡數(shù)量逐漸增多。而加入相同濃度的膽紅素前體物質(zhì)膽綠素，處理相同時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)膽綠素對(duì)海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)無(wú)影響。
　　3.海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3d后，不同濃度的膽紅素

9、處理24h，用線粒體膜電位熒光染料JC-1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著膽紅素劑量的增加，海馬神經(jīng)元線粒體膜電位降低，表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　4.海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3d后，加入不同濃度的膽紅素繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：隨著膽紅素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Ub的熒光逐漸增強(qiáng)，表明泛素化的蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)聚集增多，呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系；作用24h后，25μM的膽紅素導(dǎo)致泛素化的蛋白質(zhì)聚集成團(tuán)，堆積在突丘部位。Bax， Caspa

10、se-3的熒光結(jié)果顯示：隨著膽紅素濃度增加，熒光逐漸增加，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白增多，且神經(jīng)元凋亡數(shù)目增多。上述效應(yīng)與ps341相似。
　　5.海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3d后，膽紅素作用24h，Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：隨著膽紅素濃度的增加，泛素化的蛋白質(zhì)聚集增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax，Caspase-3增多，并且，根據(jù)濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)推測(cè)，膽紅素先抑制蛋白酶體的功能，后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，它們之間有時(shí)空關(guān)系。
　　6.1d齡的新生

11、SD大鼠，腹腔注射50μg/g，100μg/g劑量膽紅素，共2次，末次注射12h后，取海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，結(jié)果顯示：注射膽紅素后的新生鼠，海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)顯著抑制，突起長(zhǎng)度變短、數(shù)量減少，神經(jīng)細(xì)胞存活的數(shù)量明顯減少，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.新生3日齡SD大鼠腹腔持續(xù)注射膽紅素3d后顯示，隨著膽紅素濃度增高，一般表現(xiàn)逐漸變差，皮膚黃染加重；HE染色顯示：隨著膽紅素劑量的加大，腦組織神經(jīng)元細(xì)胞逐漸變小，胞漿蛋白

12、聚集和濃縮，濃度為100μg/g時(shí)部分細(xì)胞核固縮；尼氏染色顯示：尼氏小體數(shù)目明顯減少，顏色逐漸變淺，神經(jīng)元細(xì)胞變小，100μg/g劑量組神經(jīng)元部分溶解甚至消失；免疫組化實(shí)驗(yàn)和Western-blot檢測(cè)顯示結(jié)果與海馬神經(jīng)元結(jié)果一致，隨著膽紅素濃度加大，海馬組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白增多，且泛素化蛋白質(zhì)聚集增加，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論：膽紅素能導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞和新生SD大鼠神經(jīng)元損傷，主要機(jī)制是通過(guò)抑制蛋白酶體功能，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡