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文檔簡介
1、目的:通過建立大鼠神經(jīng)元膽紅素(Bilirubin,Bil)體外模型,觀察Bil對神經(jīng)元細胞活力、氧化損傷、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)活性及DNA去甲基化轉(zhuǎn)移酶(Tet1)和Klotho基因蛋白和mRNA水平變化的影響,探討B(tài)il通過氧化應(yīng)激引起Tet1介導(dǎo)的DNA去甲基化在神經(jīng)元損傷中的作用機制,為高膽紅素血癥致神經(jīng)元損傷的機理研究提供新的思路與方法。
方法:(1)采用0.025%的胰蛋白酶消化SD
2、乳鼠(出生24h以內(nèi))腦組織分離出神經(jīng)元,無血清神經(jīng)元特異性培養(yǎng)基Neurobasal培養(yǎng)單純的神經(jīng)元;(2)37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)神經(jīng)元72h后,給予低、中、高濃度的Bil(分別為25、50、100μmol/L)處理,在Bil作用4、8、12、24h后,通過MTT法檢測細胞活性;(3)Caspase-3活性檢測試劑盒及活性氧(ROS)檢測試劑盒(DCFH-DA探針法)分別檢測培養(yǎng)72h,并對不同濃度Bil作用24h后的神經(jīng)元Ca
3、spase-3活性和ROS總量水平;(4)蛋白免疫印跡(Western blot)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法分別測定培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后各組神經(jīng)元中Tet1和Klotho基因的蛋白質(zhì)表達與mRNA表達水平。
結(jié)果:(1)經(jīng)過特異性培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后,可以獲得單一的神經(jīng)元;(2)MTT結(jié)果顯示:神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用4h后,與對照組相比較,各組神經(jīng)元細胞活性均未出現(xiàn)顯著性降低(P>
4、0.05);Bil作用時間增加至8h時,與對照組相比較高濃度組神經(jīng)元活性出現(xiàn)了顯著性降低(P<0.01);Bil作用12h后,神經(jīng)元活性的變化與8h相同(P<0.01);但是當(dāng)Bil作用24h后,與對照組相比較,中濃度與高濃度Bil均能顯著性降低神經(jīng)元活性(P<0.05,P<0.01);(3)Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示:神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后,與對照組相比較,低、中、高濃度Bil均會引起神經(jīng)元中Caspa
5、se-3活性升高(P<0.01);(4)ROS檢測結(jié)果顯示:神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后,與對照組比較,在熒光顯微鏡下觀察,各濃度Bil均可引起神經(jīng)元中ROS的相對含量顯著性升高(P<0.01);(5)Western blot結(jié)果顯示:神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后,與對照組相比,低、中、高濃度組Tet1蛋白表達水平均出現(xiàn)了顯著性降低(P<0.01);與對照組相比,低、中濃度組Klotho蛋白表達水平也
6、均出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05),并且高濃度組Klotho蛋白表達水平降低更明顯(P<0.01);RT-PCR結(jié)果顯示:與對照組比低濃度Bil組神經(jīng)元中Tet1和Klotho mRNA表達水平出現(xiàn)了降低(P<0.05),同時中、高濃度Bil組的Tet1和Klotho mRNA表達降低更顯著(P<0.01)。
結(jié)論:神經(jīng)元培養(yǎng)72h并且Bil作用24h后,高濃度Bil能顯著性的降低神經(jīng)元的活性,增加神經(jīng)元內(nèi)ROS的含量,增強Ca
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