DNA甲基化在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的研究.pdf

1、第一部分散發(fā)帕金森病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA總體甲基化及DNMTs、MBPs表達(dá)水平研究
　　背景
　　帕金森病(Parkison's disease,PD)的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前認(rèn)為與遺傳因素和環(huán)境因素及其相互作用有關(guān)。表觀遺傳學(xué)為人們探索帕金森病的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)最早的、最基本的,也是研究最多的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。DNA甲基化與疾病的關(guān)系已逐漸成為醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn)之一。DNA甲基化具有組織特

2、異性,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病取材腦組織的難度較大,且難以作為后續(xù)開展生物標(biāo)記研究的依據(jù)。某些DNA甲基化改變?cè)谀X組織和外周血中具有一致性,在精神疾病和神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域,利用外周血標(biāo)本開展DNA甲基化的研究取得了一定進(jìn)展。PD作為一種全身受累的疾病,外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)是研究PD患者多巴胺能神經(jīng)元變性損傷的一種很好的外周模型。PD患者外周血中是否存在DNA總

3、體甲基化水平、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)及甲基化CpG結(jié)合蛋白(methyl binding protein,MBPs)的表達(dá)異常,目前國(guó)內(nèi)外尚無研究。
　　目的
　　探討散發(fā)PD患者PBMCs中是否存在DNA總體甲基化水平、DNMTs及MBPs表達(dá)水平的異常,并結(jié)合各臨床參數(shù)探討年齡、性別、藥物使用對(duì)DNA總體甲基化水平、DNMTs及MBPs表達(dá)水平的影響。
　　方法

4、
　　應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)對(duì)63例正常對(duì)照和62例散發(fā)PD患者PBMCs中DNA總體甲基化水平進(jìn)行檢測(cè);應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行DNMTs及MBPs的表達(dá)水平的檢測(cè);應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)兩組的測(cè)定值進(jìn)行比較。
　　結(jié)果
　　1.散發(fā)PD患者PBMCs中DNA總體甲基化水平較正常對(duì)照降低(正常對(duì)照組10.33％±0.88％vs.PD組9.92

5、％±0.98％,P＜0.05);男性PD的DNA總體甲基化水平較男性對(duì)照顯著降低(男性對(duì)照10.44％±0.89％vs.男性PD9.88％±0.88％,P＜0.05),而女性PD和女性對(duì)照的總體甲基化水平無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.病程、年齡、發(fā)病年齡以及L-dopa使用對(duì)于本組實(shí)驗(yàn)對(duì)象DNA總體甲基化水平無顯著影響(P＞0.05);
　　3.與正常對(duì)照相比,散發(fā)PD患者PBMCs中DNMTs及MBPs的mRNA表

6、達(dá)水平均顯著增高(P＜0.05);
　　4.在本組PD患者中PBMCs中:DNMT3A的mRNA表達(dá)水平和年齡呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.294,P＜0.05);MBD4的mRNA表達(dá)水平和年齡呈正相關(guān)(rs=0.238,P＜0.05);DNMT3A的mRNA表達(dá)水平在男性患者顯著低于女性患者(男性PD0.59±0.26 vs.女性PD0.83±0.34,P＜0.05);MBD3的mRNA表達(dá)水平在使用L-dopa治療的患者顯著降低(N

7、LOPD組1.21±0.34 vs.LDPD組1.03±0.22,P＜0.05)。
　　5.在本組PD患者PBMCs中,DNA總體甲基化水平與DNMT1和MBD1的mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(rs[DNMT1]=-0.497,P＜0.05,rs[MBD1]=-0.265,P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　在國(guó)內(nèi)外首次開展了散發(fā)PD患者PBMCs中DNA總體甲基化水平、DNMTs及MBPs表達(dá)水平的檢測(cè),散發(fā)性PD患者PBM

8、Cs中存在DNA總體甲基化水平、DNMTs及MBPs表達(dá)水平異常。年齡、性別、藥物使用可影響PD患者的DNA甲基化狀態(tài)。
　　第二部分 MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型黑質(zhì)部位DNA甲基化研究
　　背景
　　散發(fā)PD患者PBMCs中存在DNA甲基化異常,而PD主要病理改變主要位于中腦黑質(zhì),因此研究黑質(zhì)部位的DNA甲基化具有重要意義。MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型是研究PD發(fā)病機(jī)制、神經(jīng)生化、病理解剖、運(yùn)動(dòng)及精神障礙、藥物作用等方面

9、的應(yīng)用最廣的動(dòng)物模型。MPTP作為最早被發(fā)現(xiàn)的、最經(jīng)典的可導(dǎo)致選擇性黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元變性損傷的環(huán)境因素,其毒性作用依賴N-甲基基團(tuán)的存在。在PD患者和MPTP誘導(dǎo)的動(dòng)物模型的黑質(zhì)部位存在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的N-甲基化修飾異常,提示MPTP模型誘導(dǎo)的PD模型黑質(zhì)部位可能存在DNA甲基化修飾異常。表達(dá)譜研究表明MPTP誘導(dǎo)的靈長(zhǎng)類和嚙齒類PD模型黑質(zhì)部位基因的表達(dá)存在顯著的改變,而DNA甲基化作為一種基因表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制,是否參與了PD動(dòng)

10、物模型黑質(zhì)部位神經(jīng)元變性損害和PD癥狀的發(fā)生目前尚不清楚。
　　目的
　　本研究擬用一種環(huán)境毒素MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型并對(duì)其評(píng)價(jià)。利用這種模型進(jìn)行DNA甲基化研究,探討MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)部位是否存在DNA甲基化異常,構(gòu)建MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)部位DNA甲基化譜并尋找DNA甲基化修飾異常的PD相關(guān)基因。
　　方法
　　1.采用MPTP連續(xù)腹腔給藥的方法建立MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型,進(jìn)行行為學(xué)觀

11、察和分析,運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色和Western Blot法檢測(cè)TH表達(dá)水平。
　　2.運(yùn)用ELISA方法對(duì)MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型中腦黑質(zhì)DNA總體甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型中腦黑質(zhì)DNMTs和MBPs的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　4.采用甲基化DNA免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP)技術(shù)結(jié)合Roche-

12、NimbleGen全基因組DNA甲基化芯片分別對(duì)MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型和對(duì)照小鼠中腦黑質(zhì)部位進(jìn)行DNA甲基化比較分析,獲得MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型和對(duì)照小鼠黑質(zhì)部位DNA甲基化譜,通過比較MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型和對(duì)照小鼠DNA甲基化譜獲得DNA甲基化修飾異常的PD相關(guān)基因。
　　5.運(yùn)用重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)對(duì)MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型和對(duì)照小鼠黑質(zhì)部位Uchll啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平進(jìn)行檢測(cè);運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)MPTP誘導(dǎo)小鼠

13、PD模型和對(duì)照小鼠黑質(zhì)部位Uchll表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　1.MPTP連續(xù)腹腔給藥的方法能夠誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)震顫、肢體僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩等類似PD表現(xiàn):免疫組織化學(xué)染色顯示模型組小鼠黑質(zhì)部位TH陽性神經(jīng)元數(shù)目減少,形態(tài)異常;Western Blot顯示與對(duì)照組相比,模型組小鼠中腦背側(cè)組織TH蛋白表達(dá)無顯著改變(P＞0.05),黑質(zhì)部位TH蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.05)。
　　2.MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)部位

14、DNA總體甲基化水平較對(duì)照組顯著降低(對(duì)照組8.66％±0.92％vs.模型組7.60％±1.05％,P＜0.05)。
　　3.MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)部位能夠檢測(cè)到Dnmt1,Dnmt3a以及MBPs的mRNA表達(dá);與對(duì)照組相比,模型組小鼠黑質(zhì)部位Dnmt1、Mbd1及Mecp2的mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)。
　　4.全基因組DNA甲基化芯片分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠黑質(zhì)部位DNA有723個(gè)位點(diǎn)發(fā)生高甲基化,模

15、型組小鼠黑質(zhì)部位DNA有640個(gè)位點(diǎn)發(fā)生高甲基化。和對(duì)照組小鼠相比,在全基因組內(nèi)篩選出差異甲基化位點(diǎn)共有48個(gè),涉及44個(gè)基因,其中甲基化程度增高的基因5個(gè),甲基化程度降低的基因39個(gè)。這些甲基化差異基因參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、發(fā)育、細(xì)胞分化、凋亡調(diào)控、氧化應(yīng)激、蛋白降解等生物學(xué)過程。
　　5.與對(duì)照組小鼠相比,模型組小鼠黑質(zhì)部位Uchll啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平降低,mRNA表達(dá)水平增高,差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性(P＜0.05)

16、。
　　結(jié)論
　　在國(guó)內(nèi)外首次利用環(huán)境毒素誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型進(jìn)行DNA甲基化研究。MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)部位DNA存在甲基化修飾異常,DNA總體甲基化水平降低,Dnmt1、Mbd1及Mecp2的mRNA表達(dá)水平增高。進(jìn)一步證實(shí)MeDIP結(jié)合DNA甲基化芯片(MeDIP-Chip)技術(shù)是初步構(gòu)建DNA甲基化譜,篩選基因組DNA中甲基化修飾異常基因的相對(duì)有效手段。在MPTP誘導(dǎo)PD小鼠黑質(zhì)部位篩選出的PD相關(guān)甲基化修飾異