α-synuclein基因在帕金森病發(fā)病機制中的作用實驗研究.pdf

1、該研究采用基因工程手段,進行了人α-synuclen(h α-synuclein)基因cDNA的克隆,構建了野生型和突變型hα-synuclein的真核表達質粒pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut),將hα-synuclein基因轉染PC12細胞使其過表達,并在此基礎上觀察hα-synuclein過度表達引起細胞的形態(tài)學變化,比較野生型和突變型hα-synuclein過表達對PC12細胞的毒性作用及其對蛋白酶體抑制劑

2、的毒性易感性,初步探討了α-synuclein基因在PD發(fā)病機制中的作用,為進一步的研究奠定基礎.該課題分三個部分第一部分:野生型和突變型α-synuclein真核表達載體構建采用RT-PCR從人胚腦組織中擴增人α-synuclein基因,構建至真核表達載體pEGFP-N1中,再采用重疊延伸法(SOE法)定點突變,構建了突變型α-synuclein基因真核表達載體.結果表明所得到的片段與報道序列的同源性達100﹪(突變型達99﹪),并且

3、成功地將片段克隆到了真核表達載體上.第二部分:野生型和突變型hα-synuclein在PC12細胞中的表達將已構建的pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut)重組質粒轉染PC12細胞,Western-blot法證實細胞內有hα-synuclein(wt/mut)融合蛋白表達.野生型和突變型hα- synuclein瞬時表達對PC12細胞形態(tài)無明顯影響,它們廣泛分布于細胞核與細胞質中,與內源性α-synuclein的分布相

4、一致;采用MTT比色法證實A30P突變型hα-synuclein對PC12細胞有毒性作用;用磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnexinV)法檢測發(fā)現(xiàn)突變型α-synuclein基因瞬時表達能夠誘導PC12細胞發(fā)生凋亡.第三部分Lactacystin對過表達α- synucleinPC12細胞的毒性作用采用MTT法檢測蛋白酶體抑制劑Lactacysth對PC12細胞活性的影響,加入Lactacystin24小時后,PC12細胞活性明顯下降,呈劑量