大麻素CB1受體在帕金森病運動并發(fā)癥發(fā)病機制中作用的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是好發(fā)于中老年人的一種運動障礙性疾病，主要的病理生化改變是選擇性中腦黑質(zhì)致密部（substantia nigra compact,SNc）多巴胺能神經(jīng)元變性缺失，導致下游的紋狀體（caudate putamen，CPU）多巴胺（dopamine,DA）含量顯著性降低，臨床上主要表現(xiàn)為運動遲緩、肌強直、靜止性震顫及姿勢步態(tài)異常。目前PD仍以藥物治療為主，如主流的左旋多巴（levodo

2、pa,L-dopa）替代治療，而長期使用該藥會出現(xiàn)左旋多巴誘導異動癥（levodopa-induced dyskinesia,LID）等遠期并發(fā)癥，包括癥狀波動（motor fluctuation）和運動障礙（dyskinesia）等，目前機制不清，尚無好的處理辦法。 國內(nèi)外研究人員針對PD及其運動并發(fā)癥的發(fā)病機制進行了大量的研究工作，也取得了一些進展。隨PD病情不斷發(fā)展以及左旋多巴用藥，殘存的多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生多巴胺的能力喪失

3、，對外源性多巴胺藥物的緩沖能力降低，使得紋狀體內(nèi)多巴胺水平不能維持在生理狀態(tài)，對紋狀體中型多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons,MSNs）表面分布的多巴胺受體形成異常的波動性刺激。外源性用藥對多巴胺受體的波動性刺激可能引起MSNs信號轉(zhuǎn)導通路的變化,進而影響與之相關的其他受體的狀態(tài)及突觸傳遞效率。 多巴胺受體和谷氨酸受體共同表達于紋狀體MSNs胞膜表面，而大麻素CB1受體（cannabinoid receptor

4、 1,CB1）則位于皮質(zhì)紋狀體投射的谷氨酸能軸突末梢以及小清蛋白（parvalbumin,PV）陽性的γ-氨基丁酸（GABA）能中間神經(jīng)元軸突末梢，和MSNs形成突觸聯(lián)系。大麻素CB1系統(tǒng)包括了CB1受體和內(nèi)源性大麻素（endocannabinoid，eCB），對突觸之間的信號傳遞具有重要調(diào)節(jié)作用。突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放能夠激活突觸后神經(jīng)元合成eCB，逆行穿過突觸間隙作用于突觸前膜CB1受體，激活CB1受體可抑制突觸前Ca2+內(nèi)流，最終反饋

5、性抑制突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放。 近年研究表明，PD紋狀體長期失去多巴胺能支配，以及后續(xù)的長期多巴胺替代治療波動性刺激確實引起了大麻素CB1系統(tǒng)的一些改變。因此，對大麻素CB1系統(tǒng)的特性進行研究將是本課題的基石。此外，目前迫切需要尋找和研發(fā)新型的抗PD藥物，以彌補已有藥物的不足。國外的實驗研究發(fā)現(xiàn)，大麻素CB1系統(tǒng)對谷氨酸、GABA、多巴胺等多種重要神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用有調(diào)節(jié)功能。CB1受體激動劑可引起動物運動抑制，甚至出現(xiàn)僵硬癥（cat

6、alepsy）。并且Ferrer等研究發(fā)現(xiàn)CB1受體激動劑具有減輕左旋多巴誘導的嚴重口舌部異常不自主運動的功能。但激活CB1受體是如何減輕運動并發(fā)癥的神經(jīng)生化機制，目前尚不清楚。本研究擬采用左旋多巴長期治療誘導運動并發(fā)癥的PD大鼠模型，試探討LID的發(fā)生機制，觀察使用CB1受體激動劑對LID潛在的防治作用。 本課題共分為三個部分： 第一部分：左旋多巴誘發(fā)PD運動并發(fā)癥大鼠模型的建立和評價引言。 通過6-羥基多巴（

7、6-OHDA）立體定向注射至SD大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束（medial forebrain bundle,MFB）建立單側(cè)PD大鼠模型，然后左旋多巴（L-dopa）腹腔注射治療（50 mg/kg 加12.5mg/kg芐絲肼,每天2次）3周，觀察異常不自主運動（abnormal involuntary movements,AIM）及旋轉(zhuǎn)行為。經(jīng)左旋多巴治療長期治療，PD大鼠出現(xiàn)了AIM，包括刻板動作和對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。隨著左旋多巴用藥時間延長，PD

8、大鼠AIM呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢，同時還伴隨著單位時間劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加、旋轉(zhuǎn)反應時間縮短、關期頻率遞增等，與人類LID特征十分相似。 上述研究表明，本文成功建立了左旋多巴誘發(fā)PD運動并發(fā)癥大鼠模型，為進一步研究其形成機制奠定了物質(zhì)基礎。 第二部分：大麻素CB1受體在PD及其運動并發(fā)癥大鼠基底節(jié)的表達研究。 采用免疫組化（immunohistochemistry,IHC）染色的方法，觀察大麻素CB1受體在假手術對照組大

9、鼠、6-OHDA單側(cè)毀損PD大鼠以及長期使用左旋多巴形成LID大鼠基底節(jié)的紋狀體、蒼白球（globus pallidus,GP）以及黑質(zhì)網(wǎng)狀部（substantia nigra reticular，SNr）表達情況。Western Blot的方法，觀察假手術對照組大鼠、PD大鼠以及LID大鼠紋狀體內(nèi)CB1受體的表達量變化。實驗結果發(fā)現(xiàn)，6-OHDA單側(cè)毀損PD大鼠損傷側(cè)紋狀體和GP部位的CB1受體表達明顯增多；SNr內(nèi)的CB1受體則明顯

10、減少；長期左旋多巴治療產(chǎn)生LID的大鼠損傷側(cè)和未損側(cè)紋狀體內(nèi)CB1受體與假手術對照組比較均有增加，并以未損側(cè)增加為主，但損傷側(cè)較PD組有所降低；GP內(nèi)的CB1受體數(shù)量較對照組仍然增加；損傷側(cè)SNr CB1受體表達也顯著上調(diào)。 上述研究提示，6-OHDA損傷SNc多巴胺能神經(jīng)元可引起基底節(jié)內(nèi)CB1系統(tǒng)信號傳導改變，而長期左旋多巴治療則使CB1系統(tǒng)的改變更為復雜。大麻素CB1系統(tǒng)發(fā)生的改變可能是一種對多巴胺系統(tǒng)信號傳導改變的一種內(nèi)源

11、性代償，可能與PD及LID運動功能異常的產(chǎn)生有關。 第三部分：CB1受體激動劑WIN55212-2改善PD運動并發(fā)癥的實驗研究。 通過6-OHDA立體定向注射至大鼠右側(cè)MFB建立經(jīng)典的嚙齒類PD動物模型，對成功的PD大鼠模型進行兩套實驗：第一套實驗中PD大鼠接受每日兩次左旋多巴（50 mg/kg 加12.5 mg/kg芐絲肼,每天2次）腹腔注射，持續(xù)21天。在第22天左旋多巴注射前15min，先接受CB1受體特異性激動劑

12、WIN55212-2（1mg/kg）腹腔注射；第二套實驗中PD大鼠每日兩次分別接受WIN55212-2+左旋多巴/芐絲肼腹腔注射，共持續(xù)21天，藥物劑量同上。評估用藥后大鼠的旋轉(zhuǎn)反應時間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變化和關期發(fā)生率；采用Western Blot的方法檢測紋狀體MSNs信號傳導通路下游重要的信號蛋白DARPP-32（Thr75）、ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化情況。 結果顯示，短期應用CB1受體激動劑WIN55212

13、-2對LID作用并不明顯。長期聯(lián)合應用WIN55212-2和左旋多巴，減輕了單獨長期使用左旋多巴所至的PD大鼠旋轉(zhuǎn)反應時間縮短、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加的趨勢，并使關期發(fā)生頻率明顯減少；CB1受體阻斷劑AIM251與WIN55212-2聯(lián)合應用則消除了WIN55212-2的減輕LID效應，提示所觀察到的WIN55212-2的效應是通過CB1受體起作用的。PD大鼠紋狀體內(nèi)的DARPP-32（Thr75）磷酸化與假手術相比未見明顯變化，而左旋多巴使

14、之降低，WIN55212-2與左旋多巴合用，DARPP-32（Thr75）降低更為顯著；ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化在PD紋狀體則減少，長期左旋多巴治療使ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化明顯增加，聯(lián)用CB1受體激動劑和左旋多巴并未使ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化恢復正常，仍然高于對照組。 上述研究表明，WIN55212-2是通過CB1受體起作用的，激動CB1受體可能對于PD左旋多巴誘導的運動并