神經(jīng)炎癥在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、第一部分帕金森病小鼠模型血腦屏障緊密連接蛋白改變以及促紅細(xì)胞生成素對其影響的研究
　　 目的：帕金森病發(fā)病機(jī)制仍然不甚清楚。帕金森病存在血腦屏障破壞，帕金森病的病理過程至少部分和血腦屏障功能破壞有關(guān)，血腦屏障緊密連接蛋白包括ZO-1和occludin 可以被基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）降解。有些藥物抑制基質(zhì)金屬蛋白酶后可以保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元丟失。促紅細(xì)胞生成素可以保護(hù)很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的血腦屏障免受破壞。本實(shí)驗(yàn)研究亞急性1-甲

2、基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）帕金森病小鼠模型黑質(zhì)和紋狀體ZO-1和occludin的蛋白表達(dá)水平以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9和MMP2)活性變化。系統(tǒng)注射促紅細(xì)胞生成素對MMP9、MMP2 活性和ZO-1、occludin蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：雄性C57BL/6 小鼠分為4組，第1組腹腔注射等量的PBS 一周；第2組腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素（5,000 IU/kg/day，I.p.）一周；第3組

3、模型組接受MPTP（20 mg/kg/day）腹腔注射一周，制作亞急性MPTP 帕金森病小鼠模型；第4組接受MPTP 腹腔注射 (20 mg/kg/day，I.p.)一周，在每次注射MPTP 之前30分鐘腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素（5,000 IU/kg/day，I.p.）作為預(yù)先干預(yù)處理。4組小鼠在末次注射1天后殺鼠取腦。采用明膠酶譜法檢測腹側(cè)中腦和紋狀體MMP9和MMP2 活性，免疫印跡法分析ZO-1和occludin 蛋白水平變

4、化。酪氨酸羥化酶免疫組化觀察中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失情況。結(jié)果：亞急性MPTP 帕金森病模型組小鼠腹側(cè)中腦和紋狀體MMP9和MMP2 活性增高，ZO-1和occludin 蛋白表達(dá)水平下降。促紅細(xì)胞生成素可以降低MMP9和MMP2 活性，減少ZO-1和occludin 蛋白表達(dá)水平下降。帕金森病模型小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量減少，促紅細(xì)胞生成素可以顯著緩解TH 陽性細(xì)胞數(shù)量的減少。
　　 結(jié)論：帕金森病小鼠模型反映血腦屏障破壞的

5、緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)降低伴隨著MMP9和MMP2活性升高，這說明血腦屏障破壞可能與MMP9和MMP2活性增高有關(guān)。促紅細(xì)胞生成素的神經(jīng)保護(hù)作用可能與降低MMP9、MMP2 活性進(jìn)而減輕血腦屏障緊密連接蛋白破壞有關(guān)。
　　 第二部分 VCAM-1，CD49d和ICAM-1在帕金森病中表達(dá)的研究
　　 目的：近年來的研究發(fā)現(xiàn)帕金森病動物模型黑質(zhì)存在CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞，而且證實(shí)CD4+淋巴細(xì)胞腦實(shí)

6、質(zhì)浸潤促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元死亡。經(jīng)典的淋巴細(xì)胞遷移模型需要VCAM-1/VLA-4（CD49d）、ICAM-1/LFA-1 兩對受體配體的相互作用。本實(shí)驗(yàn)研究帕金森病中粘附分子VCAM-1，CD49d和ICAM-1的表達(dá)，以確定這些粘附分子是否在淋巴細(xì)胞浸潤中發(fā)揮作用，以探討T細(xì)胞通過血腦屏障的可能機(jī)制。
　　 方法：腹腔注射MPTP 制作急性（20 mg/kg，4 次，每次間隔2 h）帕金森病小鼠模型，模型組小鼠分別在末次注射M

7、PTP 1 d和7d后取腦組織，正常對照組注射等量的PBS。用免疫組織化學(xué)染色，觀察急性帕金森病小鼠模型中腦CD8 陽性淋巴細(xì)胞表達(dá)情況。用熒光定量PCR或免疫印跡法檢測MPTP 急性帕金森病小鼠模型腹側(cè)中腦VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測帕金森病患者和正常人外周血CD4+細(xì)胞上VCAM-1的配體VLA-4（CD49d）的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：急性MPTP 帕金森病小鼠模型腹側(cè)中腦存在CD8 陽性淋巴細(xì)胞

8、。與對照組相比，模型組VCAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。與正常對照相比，帕金森病患者CD4+細(xì)胞表達(dá)VLA-4（CD49d）沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。帕金森病動物模型腹側(cè)中腦ICAM-1 蛋白表達(dá)水平明顯增高，高于正常對照組小鼠。
　　 結(jié)論：ICAM-1在MPTP 帕金森病小鼠腹側(cè)中腦表達(dá)增高，可能與CD4+淋巴細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤有關(guān)。針對ICAM-1的阻斷中和處理有可能減少淋巴細(xì)胞浸潤，或許可作為一種新的帕金森病治療

9、措施。
　　 第三部分MPTP 對C57BL/6 小鼠不同腦區(qū)中CD14 mRNA、TLR2mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)影響的研究
　　 目的：本部分實(shí)驗(yàn)研究MPTP 對C57BL/6 小鼠不同腦區(qū)中CD14 mRNA、TLR2mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)影響。
　　 方法：MPTP 腹腔注射制作急性和亞急性帕金森病小鼠模型。MPTP 20mg/kg/次，一共注射4 次，每次間隔時間為2 小時，在一天時間

10、內(nèi)注射完畢（急性模型劑量和給藥）；20 mg/kg/d，每天1 次，一共注射7天（亞急性模型劑量和給藥）。本實(shí)驗(yàn)研究分為四組，8～10周齡對照組、8月齡中年小鼠組、急性模型組、亞急性模型組，6只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分配到各組。在末次注射1天后，取所有小鼠不同腦區(qū)的組織（腹側(cè)中腦和紋狀體）。觀察亞急性小鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目改變情況采用酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化方法。用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組織化學(xué)染色，觀察亞急性小

11、鼠模型腹側(cè)中腦和紋狀體中炎性標(biāo)志細(xì)胞—星型膠質(zhì)細(xì)胞改變的情況。用RT-PCR方法檢測CD14 mRNA、TLR4 mRNA以及TLR2 mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：亞急性小鼠模型黑質(zhì)TH 陽性細(xì)胞減少，腹側(cè)中腦和紋狀體GFAP 陽性細(xì)胞明顯增多。與正常對照組和中年小鼠組相比，急性和亞急性模型組小鼠黑質(zhì)和紋狀體CD14 mRNA表達(dá)水平明顯增高，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表達(dá)各組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。