利用腺相關(guān)病毒標(biāo)記特定環(huán)路神經(jīng)元及其細(xì)胞核的分離與DNA甲基化研究.pdf

1、大腦作為人體最為復(fù)雜、精密的器官，由數(shù)百億個(gè)神經(jīng)元構(gòu)成。單個(gè)神經(jīng)元通過突觸結(jié)構(gòu)與其他神經(jīng)元連接并形成具有功能的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而賦予動(dòng)物個(gè)體意識(shí)與行為?；诮M織樣本投入的傳統(tǒng)建庫測(cè)序技術(shù)會(huì)掩蓋神經(jīng)元彼此間存在的異質(zhì)性，不適用于單神經(jīng)元研究，同時(shí)，不同神經(jīng)元的形態(tài)、功能以及基因表達(dá)存在的差異性由表觀遺傳因素所決定。因此研究提出了一種對(duì)單神經(jīng)元示蹤標(biāo)記及其細(xì)胞核分離的研究方法，并選取表觀遺傳的重要形式——DNA甲基化作為研究對(duì)象。
　　在

2、對(duì)重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的構(gòu)建工作中，本課題首先構(gòu)建了表達(dá)目的核膜蛋白的腺相關(guān)病毒重組載體pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag，分別用廣譜啟動(dòng)子CMV和神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子hSyn在細(xì)胞系轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)體外表達(dá)和鼠腦神經(jīng)元活體表達(dá)表達(dá)目的核膜蛋白。構(gòu)建載體被轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293T細(xì)胞以進(jìn)行驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞通過熒光顯微鏡觀察，可見熒光信號(hào)呈圓形分布、邊緣更加明亮，說明目的核膜蛋白如預(yù)期實(shí)現(xiàn)核膜定位標(biāo)記。但通

3、過病毒鼠腦注射實(shí)驗(yàn)對(duì)所包裝重組病毒載體進(jìn)行驗(yàn)證，未能在腦切片上觀察到熒光信號(hào)。由于可能存在因啟動(dòng)子差異或是實(shí)驗(yàn)操作因素造成陰性結(jié)果的可能，本研究也構(gòu)建包裝了腺相關(guān)病毒重組載體rAAV-hSyn-eGFP-NLS，并對(duì)其進(jìn)行活體注射，在腦切片可觀察到大量被熒光標(biāo)記的神經(jīng)元，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)海馬投射內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的逆向標(biāo)記，從而排除上述可能性。
　　在分離被標(biāo)記細(xì)胞核的研究過程中，本課題通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式模擬被重組病毒標(biāo)記的神經(jīng)元。研究過程

4、中，首先對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行勻漿處理及密度梯度離心，以分離細(xì)胞核。分離到的細(xì)胞核形態(tài)完整且雜質(zhì)較少。之后通過免疫共沉淀的方式對(duì)被標(biāo)記細(xì)胞核細(xì)胞核進(jìn)行捕獲，所捕獲細(xì)胞核陽性率約為70％，捕獲率在65％～85％。同時(shí)對(duì)照組陰性細(xì)胞核漂洗后的殘留率僅為0.18％，因此可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組中陰性細(xì)胞核已基本漂洗干凈，該實(shí)驗(yàn)方法可己滿足后續(xù)研究需求。
　　在利用單細(xì)胞進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序建庫的研究過程中，本課題參照單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序(scBS-seq

5、)的方法，先后分別以寡量細(xì)胞及單個(gè)神經(jīng)元作為建庫投入，成功獲得DNA甲基化測(cè)序建庫。所建文庫經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，文庫片段分布大小與預(yù)期相符(300bp～500bp)，同時(shí)條帶明亮，滿足上機(jī)測(cè)序要求。同時(shí)對(duì)測(cè)試樣本的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)文庫測(cè)序質(zhì)量較好，且組間因建庫操作造成的差異較小，因此認(rèn)為該方法具有較好的可重復(fù)性。
　　針對(duì)本課題所遇到AAV載體裝載容量受限的問題，本文最后還對(duì)如何現(xiàn)有提高AAV裝載容量的研究進(jìn)行論