宮頸細胞HPV16病毒DNA甲基化與宮頸病變相關性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌的主要病因。表觀遺傳學事件在癌癥的發(fā)生過程中起著重要的作用，幾乎所有的癌癥類型均表現(xiàn)出異常的甲基化狀況，且涉及全基因組。本研究旨在分析臨床樣本中HPV16病毒長控制區(qū)增強子（LCR Enhancer）和E6基因啟動子（E6promoter）兩段序列中的11個位點（7533、7551、7674、7680、7

2、692、7860、31、37、43、52、58）的甲基化圖譜，結合患者的臨床資料，分析病毒DNA甲基化程度差異與臨床病變程度的相關性，初步探討甲基化程度差異與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關系，為今后從分子生物學、表觀遺傳學角度闡明HPV致病機制，進而預測患者宮頸病變的進展及預后等相關問題提供研究基礎。
　　 研究方法和步驟：
　　 所用的TCT標本均來自2009年11月至2010年6月在北京協(xié)和醫(yī)院門診就診的宮頸病變及常規(guī)婦科檢查的

3、患者，一共收集TCT標本324例，其中HPV感染244例，用多對引物PCR擴增分型后確定單一型別HPV感染146例，混合感染98例。其中單一HPV16感染51例（ASCUS6例，正常5例，LSIL7例，HSIL19例，SCC14例）。在對原始標本提取DNA后，從單一HPV16感染中選擇26例、從混合感染中選擇4例（HPV16感染為主，細胞學診斷均為正常），總計30例樣本納入全程研究。其中正常組6例（4例為混合感染），LSIL組7例，HS

4、IL組10例，SCC組7例。另從醫(yī)科院基礎所細胞中心購得SiHa細胞系1株作為平行對照。SCC組全部病例和HSIL組部分病例有北京協(xié)和醫(yī)院病理科的病理診斷。
　　 從原始樣本中提取DNA，然后用試劑盒對提取的DNA行重亞硫酸鹽修飾，再用BSP引物PCR擴增目的片段，在電泳驗證目的片段存在后，將PCR產物質粒轉化E..coli克隆，隨機挑取數個克隆，對目的片段進行測序，從而確定目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀況。
　　

5、 采用描述性和圖表的方法來匯總分析數據，根據圖譜可以直觀的反映出CpG位點的甲基化頻率。同時采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件分析數據。組間甲基化率差異比較用Fisher精確概率檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。各位點的甲基化率用Student's t檢驗，顯著高于0（與0比較P<0.05）有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、實驗中一共測序確定了1013個CpG位點的甲基化狀況，一共有45個CpG位點

6、發(fā)生甲基化，總體甲基化率為4.4％。在11個CpG位點中，位點7533、7551、7680、7860均未測得甲基化發(fā)生，位點7674、7692的總體甲基化率約為2％，位點31、37、43、52、58的總體甲基化率約為8％。
　　 2、絕大多數的甲基化都發(fā)生在SCC組。SCC組在7674、31、37、43、52、58位點上發(fā)生了明顯的甲基化，7674位點甲基化率約為8％，余各位點甲基化率在20％以上，均顯著高于0（Student’

7、s t檢驗，P<0.0001）。SCC組與HSIL組間甲基化率差異顯著（P<0.01，F(xiàn)isher精確概率檢驗）。
　　 3、正常組和LSIL組甲基化現(xiàn)象罕見，但由于樣本量限制，正常組/LSIL組與HSIL組/SCC組間無法進行有意義的統(tǒng)計學比較。
　　 4、測定了1株SiHa細胞的5個拷貝的甲基化情況，在LCR Enhancer序列的5個位點有甲基化發(fā)生。
　　 結論：
　　 1、在LCR Enhanc