應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)行HPV分型檢測(cè)及HPV16甲基化狀態(tài)與宮頸致癌作用研究.pdf

1、一、焦磷酸測(cè)序技術(shù)行宮頸脫落細(xì)胞Hr-HPV（高危型HPV）分型檢測(cè)
　　 目的：評(píng)價(jià)焦磷酸測(cè)序技術(shù)在Hr-HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，分析此方法的準(zhǔn)確性、檢出高級(jí)別宮頸病變的有效性，及應(yīng)用于臨床檢查和大規(guī)模篩查的可行性。同時(shí)獲取以陰道鏡門診患者為研究人群的Hr-HPV感染比例及所感染病毒型別的分布。
　　 內(nèi)容：以200名陰道鏡門診患者為研究對(duì)象，所有患者均接受宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）、HC-Ⅱ檢測(cè)、焦磷酸測(cè)序Hr

2、-HPV分型檢查。評(píng)估焦磷酸測(cè)序技術(shù)在宮頸Hr-HPV檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值；分析焦磷酸測(cè)序Hr-HPV檢查結(jié)果與HC-Ⅱ檢測(cè)的一致性；評(píng)價(jià)焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢出宮頸高級(jí)別病變（CINⅡ及以上病變）的價(jià)值；分析研究人群中Hr-HPV型別分布。
　　 方法：應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)12型Hr-HPV（包括HPV16，18，31,33，35，39，45，51，52，56，58和59）感染。自宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查剩余細(xì)胞中提取DNA，經(jīng)HPV通用型引

3、物擴(kuò)增后，行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)以上12型Hr-HPV，其中每四種型別測(cè)序引物至于同一反應(yīng)池中，僅需10分鐘即可完成測(cè)序反應(yīng)。分析此種檢測(cè)技術(shù)與美國(guó)FDA唯一認(rèn)證的HPV臨床檢測(cè)手段-HC-Ⅱ方法檢測(cè)出Hr-HPV感染的一致性；評(píng)價(jià)其作為宮頸癌及宮頸癌前病變篩查手段的有效性；根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定標(biāo)本中特異型別的Hr-HPV感染，了解研究人群中Hr-HPV感染的型別分布。并將通用型引物PCR陽(yáng)性而焦磷酸測(cè)序陰性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物純化、克隆后行傳統(tǒng)測(cè)序

4、分型檢測(cè)，確定所感染的HPV型別。
　　 結(jié)果：經(jīng)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)200例研究對(duì)象中Hr-HPV感染98例，其中單一感染88例，雙重感染10例，檢測(cè)出9種Hr-HPV感染（HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV39，HPV45，HPV52，HPV58和HPV59）。Hr-HPV感染中，HPV16感染率為69.4％，占第一位；HPV-58感染率為16.3％，占第二位。焦磷酸測(cè)序檢測(cè)出的Hr-HPV感染率與宮頸病

5、變呈正相關(guān)關(guān)系（Kendall值為0.704，P<0.001）；此方法檢出高級(jí)別宮頸疾患的敏感性和特異性分別為95％和65.1％，ROC曲線下面積為0.80；焦磷酸測(cè)序檢測(cè)Hr-HPV與HC-Ⅱ方法有高度的一致性（Kappa值為0.791，P<0.001）。
　　 結(jié)論：焦磷酸測(cè)序檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于Hr-HPV檢測(cè)與HC-Ⅱ方法有很好地一致性，并可以進(jìn)行HPV分型檢測(cè)。其對(duì)宮頸CINⅡ及以上病變具有很好的檢出率。是宮頸癌及癌前病變篩

6、查的有效手段。
　　 二、應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)HPV16 L1片段3’端和LCR上CpG位點(diǎn)甲基化水平行定位、定量檢測(cè)并分析與HPV16致宮頸癌作用相關(guān)性
　　 目的：應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)定位、定量檢測(cè)位于HPV16 L1片段3’端和LCR上的21個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化率，分析比較無(wú)宮頸病變攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者間各甲基化位點(diǎn)甲基化率差異，了解HPV16甲基化與其致病性的關(guān)系。
　　 內(nèi)容：以HPV16陽(yáng)性的

7、無(wú)宮頸病變病毒攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者各30例為研究對(duì)象，研究各組患者所感染HPV16病毒L1片段3’端和LCR片段甲基化位點(diǎn)的甲基化狀念，分析評(píng)價(jià)HPV16甲基化與其致病性間關(guān)系。
　　 方法：選擇HPV16陽(yáng)性的無(wú)宮頸病變病毒攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者各30例，使用宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查剩余細(xì)胞提取DNA，經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，分7個(gè)片段擴(kuò)增HPV16 L1片段3’端和LCR區(qū)域（此區(qū)域包含E6/E7啟動(dòng)子增強(qiáng)子及E2結(jié)

8、合位點(diǎn)），應(yīng)用焦磷酸檢測(cè)技術(shù)經(jīng)測(cè)序分析檢測(cè)研究片段所涉及的21個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，比較每一個(gè)甲基化位點(diǎn)甲基化率在三組患者間是否存在差異，評(píng)價(jià)HPV16甲基化與其致病性間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：經(jīng)定位、定量檢測(cè)HPV16目的片段上21個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平，發(fā)現(xiàn)位于E6/E7啟動(dòng)子的5個(gè)甲基化位點(diǎn)均存在隨病情進(jìn)展甲基化率逐漸減低趨勢(shì)，在無(wú)宮頸病變病毒攜帶者、CIN患者和宮頸癌患者三組間存在顯著性差異。位于L1片段3’端7032，

9、7019，7136三個(gè)位點(diǎn)的甲基化率在三組間存在顯著性差異，7032和7019位點(diǎn)無(wú)病變攜帶者甲基化率最低，宮頸癌者甲基化率最高，7136位點(diǎn)CIN組甲基化率最高，宮頸癌組次之，無(wú)病變者最低。
　　 結(jié)論：HPV16 L1片段3’端及E6/E7啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化率在三組患者中存在顯著性差異，這種甲基化差異可促進(jìn)HPV16與宿主基因整合、E6/E7癌基因表達(dá)從而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。HPV16甲基化狀況可能成為鑒別HPV16自愈性